CN106978409B - 一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的是一种α‑葡萄糖苷酶的高效制备方法，以微生物或植物来源的α‑葡萄糖苷酶基因碱基序列为依据，筛选获得催化性能显著提升的α‑葡萄糖苷酶编码基因，然后再通过引入强启动子和高分泌效率信号肽元件，借助重构的表达质粒增加α‑葡萄糖苷酶基因拷贝数，获得了高效分泌表达α‑葡萄糖苷酶的重组菌，结合酶活力差异性筛选获得活力最高的菌株；结合该菌株的生长特征和产酶特征建立30m³发酵体系下的α‑葡萄糖苷酶高效分泌表达方法。本发明筛选获得高强度启动子的表达方法可以保证α‑葡萄糖苷酶转录过程的高水平和后续表达过程的高表达量。

Description

一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法

技术领域

本发明提供一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法，属于微生物、基因工程领域。

背景技术

α-葡萄糖苷酶，又称葡萄糖基转移酶（α-glucosidase,EC.3.2.1.20），系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它在糖的催化反应中具有水解和转糖苷的双重作用。水解作用可从α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非还原性末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖；转糖苷作用又可将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一个葡萄糖或麦芽糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖（简称IMO）。

自20世纪80年代日本从黑曲霉中筛选出α-葡萄糖苷酶生产菌种，并得以工业化生产酶制剂以来，α-葡萄糖苷酶在基础研究和工业生产上发挥着越来越重要的作用。目前，国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶，酶活较高；而国内主要以粗酶液为主，酶活较低。而且，国内尚未有商品化α-葡萄糖苷酶酶制剂出售，用于生产的酶均来自国外少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵，导致IMO的生产成本居高不，一定程度上制约了我国IMO产业的发展。选育α-葡萄糖苷酶的高产菌种并建立相应的高效制备工艺是实现α-葡萄糖苷酶低成本商业化制造的关键所在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法。以微生物或植物来源的α-葡萄糖苷酶基因碱基序列为依据，参考目标宿主菌的密码子偏好性进行密码子优化，并通过采用长引物和低温易错PCR的筛选获得催化性能显著提升的α-葡萄糖苷酶编码基因，然后再通过引入强启动子和高分泌效率信号肽等元件，借助重构的表达质粒增加α-葡萄糖苷酶基因拷贝数，获得了高效分泌表达α-葡萄糖苷酶的重组菌，结合酶活力差异性筛选获得活力最高的菌株。结合该菌株的生长特征和产酶特征建立30m³发酵体系下的α-葡萄糖苷酶高效分泌表达工艺。

上述α-葡萄糖苷酶基因的获得方式既可以是以来源微生物的染色体DNA为模板PCR扩增获得，也可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列采用全基因合成的方法获得，更可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列为依据结合目标宿主菌的密码子偏好型的重新设计并合成。

上述获得的优选后的α-葡萄糖苷酶基因克隆表达的目标宿主菌为可高效分泌表达多种蛋白的菌株，且该目标菌株可以根据需要进行遗传修饰。目标宿主菌可以是黑曲霉，烟曲霉，米曲霉，地衣芽胞杆菌，枯草芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母等，也可以是其他食品安全微生物。

上述获得的优选后的α-葡萄糖苷酶基因可以在目标宿主菌自身优势基因的启动子序列下游进行高效转录过程。优势基因的启动子可是来源于目标宿主菌的蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，糖苷酶，等等相关基因的操纵子。

上述获得的优选后的α-葡萄糖苷酶基因可以在目标宿主菌自身优势基因的信号肽序列下游进行高效分泌表达过程。优势基因的信号肽可是来源于目标宿主菌的蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，糖苷酶，等等相关基因的操纵子。

上述用于优选后的α-葡萄糖苷酶基因高效表达的质粒载体可以是1-4个拷贝的质粒，也可以是400个拷贝左右的质粒，更可以是温度诱导调控型质粒整体。更重要的是该质粒载体同时携带了在目标宿主菌和大肠杆菌中高效复制需要的复制子，便于质粒在目标宿主菌中的高拷贝复制。

获得重组可以在简单发酵工艺下实现目标蛋白在30m³发酵体系下的高效制备。

优选的，所述微生物或植物来源的α-葡萄糖苷酶基因为黑曲霉α-葡萄糖苷酶的编码基因agA，agB，agC，agD，agE，agF。

采用的长引物序列如下：

agXtemP1：ATGGTTAAACTGCCCTTTAACATCCAAATGTTTTCTACTTCCATTACGG；

agXtemP2：TTACCATTCAAACGTTAGTTGAAACGAACGTAACGAGAGTCAACATCCCA。

优选获得的催化性能显著提升的α-葡萄糖苷酶编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的有益效果在于：

本发明中所使用的α-葡萄糖苷酶其编码基因经过密码子优化等策略改造并通过催化性能筛选获得，具备高催化性能等特点。

本发明中所使用的α-葡萄糖苷酶的表达方法，特别是筛选获得高强度启动子的表达方法可以保证α-葡萄糖苷酶转录过程的高水平和后续表达过程的高表达量。

本发明中所使用的α-葡萄糖苷酶的表达方法，特别是筛选获得分泌性能优良的信号肽的表达方法可以保证α-葡萄糖苷酶分泌过程的高效性和后续表达过程的高表达量。

本发明中所使用的α-葡萄糖苷酶的表达方法，特别是高拷贝穿梭型质粒的表达方法既可保证重组质粒在构建过程中的便捷性，也可保证目标宿主菌中表达过程的高表达量。

本发明中所获得的α-葡萄糖苷酶的高产菌株具备生长和产酶特性稳定，发酵产酶过程易于放大生产的特征。

本发明中所形成的α-葡萄糖苷酶制备工艺，具备工艺简单，操作稳定等特点，大大降低操作难度，节约经济成本。

本发明所形成的α-葡萄糖苷酶制备工艺，可实现10吨到30吨及更大规模的高活性α-葡萄糖苷酶的高效制备过程。

附图说明

图1所示的是筛选获得的α-葡萄糖苷酶编码基因高效表达质粒的物理图谱。

图2所示的是筛选获得的多个α-葡萄糖苷酶最适作用pH的差异性。

图3所示的是筛选获得的多个α-葡萄糖苷酶最适作用温度的差异性。

图4所示的是α-葡萄糖苷酶用于制备低聚异麦芽糖浆组份分析图谱。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

（1）采用Thermofisher公司的TRIZol^® Plus RNA 纯化系统将TRIzol®试剂的裂解能力与PureLink^® RNA小量提取试剂盒硅胶离心柱方便的RNA提取技术相结合，快速分离提取黑曲霉总RNA。

（2）在逆转录酶试剂盒EnzChek^® Reverse Transcriptase Assay Kit的作用下合成cDNA，以上述cDNA为模板分别使用引物对agA1/agA2；agB1/agB2；agC1/agC2；agD1/agD2；agE1/agE2；agF1/agF2获得α-葡萄糖苷酶的编码基因agA，agB，agC，agD，agE，agF（各序列信息分贝为XM_001396469.2、XM_001393862.2、XM_001391091.2、XM_001402016.2、XM_001400418.2、XM_001388877.2）。

（3）上述获得的α-葡萄糖苷酶的编码基因克隆入pPIC9K质粒的SnaBI/EcoRI位点中获得重组质粒pPIC-agA~F。

（4）将重组质粒pPIC-agA~F线性化后电击转化的方式在毕赤酵母GS115中整合表达。并通过组氨酸营养缺陷型筛选和G418抗性筛选获得阳性转化子。

（5）将上述获得的阳性转化子采用Thermofisher（Invitrogen）公司提供的毕赤酵母操作手册阳性转化子发酵验证方法制备酶液。测定酶液中的α-葡萄糖苷酶酶活并进一步筛选目标转化子。

（6）以筛选获得的目标转化子其氨基酸序列为依据，参考枯草芽胞杆菌的密码子偏好性优化上述基因的核酸序列，密码子优化过程中消除原有基因中已有的SmaI和EcoRI位点同时不形成新的上述两个酶切位点，并通过全基因合成的方式获得酶活最优的相关α-葡萄糖苷酶编码基因。

（7）以上述全合成的基因片段为模板采用通用长引物和低温易错PCR的组合方式获得全新的基因片段。上下游引物分别引入SmaI和EcoRI位点。

（8）以枯草芽胞杆菌BF7658的染色体DNA为模板，使用引物对SPamy1/ SPamy2扩增获得其淀粉酶基因的信号肽并克隆入重组质粒pHY-P43的BamHI和SmaI位点。获得重组枯草芽胞杆菌pHY-P43-SPamy。

（9）上述基因片段克隆入pHY-P43-SPamy载体的SmaI和EcoRI位点。获得重组质粒。

（10）上述获得的重组枯草芽胞杆菌转子经摇瓶发酵制备酶液并在65℃条件下筛选高酶活的α-葡萄糖苷酶产生菌株。

（11）结合重组菌生长和产酶特性建立高效制备工艺。

具体的技术方法：

（1）α-葡萄糖苷酶agD基因在枯草芽胞杆菌BF7658中的表达；

以来源于黑曲霉的agD基因cDNA序列为依据，参照枯草芽胞杆菌的密码子偏好性，全基因合成agDbs基因，密码子优化的过程中同时消除原有基因中已有的SmaI和EcoRI位点同时不形成新的上述两个酶切位点；

（2） PCR扩增获得启动子序列片段、信号肽序列片段和α-葡萄糖苷酶基因片段。

（3）大肠杆菌DH5α化转感受态的制备；

（4）启动子序列片段、信号肽序列片段和α-葡萄糖苷酶基因片段与表达载体连接转化

（5） 重组质粒转化目标宿主菌；

（6） 酶活测定方法：

1) 国标法测定α-葡萄糖苷酶酶活原理

用α-葡萄糖苷酶作用底物α-甲基-D-葡萄糖苷生成葡萄糖，所生成的葡萄糖与含有葡萄糖氧化酶、过氧化物酶的4-氨基安替比林和酚试剂进行显色反应来定量测定。在此试验条件下，在反应混合物2.5 mL中，60 min产生l μg葡萄糖所需的酶量定义为一个α-葡萄糖苷酶活力单位。

其化学反应式如下：

2) 国标法测定α-葡萄糖苷酶酶活步骤

a. 精确称取105℃下干燥6 h的葡萄糖1 g, 溶于100 mL水中，分别取1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，用水定容至100 mL（每1 mL该溶液分别含有100 μg，200 μg，300 μg，400μg，500 μg的葡萄糖）。

分别吸取以上葡萄糖标准液0.1 mL和4-氨基安替比林-苯酚显色剂3 mL ，加入试管内，混匀。将这些试管放入(40土0.5)℃的恒温水浴箱中，保温20 min，测定波长500 nm处的吸光度As₁₀，As₂₀，As₃₀，As₄₀，As₅₀。标准液的空白对照：用水来替代葡萄搪标准液，按上述方法测定空白对照液吸光度As₀。

b. 吸取底物溶液1 mL和0.02 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液( pH 5.0 )1 mL加入试管内，在(40土0.5)℃的恒温水浴箱中保温10 min。加入稀释酶液0.5 mL，混匀，于(40土0.5)℃的恒温水浴箱中准确保温60 min后，将试管转移至沸水浴中加热5 min，然后用流水快速冷却。冷却后，吸此溶液0.1 mL到试管中，并加入4-氨基安替比林-苯酚显色剂3 mL，混匀。将此试管放入(40土0.5)℃的恒温水浴中，保温20 min，测定500 nm处的吸光度A₆₀。

空白对照：吸0.02 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液( pH 5.0 ) 1mL和样品稀释酶液0.5mL加入试管内，混匀。将试管转移至沸水浴中加热5 min，然后用流水快速冷却。冷却后，加入底物溶液1 mL，混匀。吸此溶液0.1 mL至空试管内，加入4-氨基安替比林-苯酚显色剂3mL，混匀。将此试管放入(40土0.5)℃的恒温水浴中，保温20 min，测定500 nm处的吸光度A₀。

3) 国标法测定α-葡萄糖苷酶酶活的计算

相当于吸光度差为1.000时的葡萄搪的量G (μg)

α-葡萄糖苷酶活力计算：

式中：A₆₀-样品反应液的吸光度;

A₀-空白溶液的吸光度;

G-吸光度差为1.000时，由葡萄糖标准曲线求得的葡萄糖量，μg。

2.5-反应体系的总容量，mL；

0.1-反应体系的取样量，mL；

n-酶样品的稀释倍数；

0.5-反应体系中酶样品的添加量，mL。

4) 生物传感仪法测定α-葡萄糖苷酶酶活原理

用α-葡萄糖苷酶作用底物 a-甲基-D-葡萄糖苷，利用生物传感仪测定60 min时，在反应混合物2.5 mL中，产生l μgD-葡萄糖所需的酶量，化学反应式如下：

实施例1. α-葡萄糖苷酶编码基因在毕赤酵母中的克隆和表达

以黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株（江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn）为出发菌株进行培养，收集菌体。采用TRNzol总RNA提取试剂提取它们的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo (dT)为引物逆转录合成第一链cDNA。

分别以染色体DNA或第一链cDNA为模板，使用引物（SEQ ID NO. 2～SEQ IDNO.13；相邻的两个为一对上下游引物）进行PCR扩增出α-葡萄糖苷酶的编码基因agA、agB、agC、agD、agE和agF。PCR反应条件如下：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物与质粒pPIC9K分别用SnaB I和EcoRI进行酶切、纯化，再进行连接，转化Escheriachia coli JM109感受态细胞。用含有氨苄青霉素的LB固体培养基筛选阳性转化子，并提取其质粒，用限制性内切酶酶切进行验证。

毕赤酵母的遗传转化及筛选：分别将构建成功的6个重组质粒pPIC9K-agA、pPIC9K-agB、pPIC9K-agC、pPIC9K-agD、pPIC9K-agE和pPIC9K-agF（图4）用Sac I或Sal I进行单酶切线性化。酶切产物经纯化回收后电转化转化Pichia pastoris GS115，均匀涂布于MD平板，30℃恒温培养至单菌落形成。挑取多个单克隆重组酵母分别接种于终浓度为0.5、2mg/mL G418的 YPD平板上进行筛选，30℃培养箱培养至长出单菌落，挑取生长情况好的重组酵母菌株保存，并分别对这6株重组菌进行命名AGa、AGb、AGc、AGd、AGe和AGf。采用毕赤酵母操作手册给定的培养方法和甲醇诱导发酵方法制备相应的α-葡萄糖苷酶酶液。

（1）将筛选的重组酵母菌株与对照菌株毕赤酵母GS115进行划线活化，挑取单菌落分别接种到50 mL YPD液体培养基中（含有终浓度为50 μg/mL卡那霉素），30℃、180 r/min培养16～18 h；

（2）按1%接种量分别接入50 mL BMGY 液体培养基中（含有终浓度为50 μg/mL卡那霉素），30℃，180 r/min培养至OD600=2～6 (约16～18小时)；

（3）收集菌液于灭菌的50 mL离心管中，8000 r/min，离心5 min，倒掉上清，用1/5-1/10原培养基体积的BMMY重悬细胞，使菌体的OD₆₀₀=1进行培养，加入甲醇至终浓度为0.5%进行诱导，放入30℃摇床继续培养；

（4）发酵96小时取样测酶活（按照前述方法进行测定），并加入甲醇至终浓度为0.5%进行诱导。

测定酶活列于表1。

表1重组毕赤酵母中α-葡萄糖苷酶的合成水平

实施例2. α-葡萄糖苷酶编码基因在枯草芽胞杆菌中的克隆和表达

以枯草芽胞杆菌BF7658的染色体DNA为模板，使用引物对Samy1/ Samy2扩增获得其淀粉酶基因的信号肽并克隆入重组质粒pHY-P43的BamHI和SmaI位点。获得重组枯草芽胞杆菌pHY-P43-Samy。Samy1/ Samy2序列为Samy1：CGGGGTACCAAAAAATCAAATAAGGAG；Samy2：CGCGGATCCTGTAAGCTCATTCGATTTGTT。

以上述确认催化活性的α-葡萄糖苷酶编码基因核酸序列为依据，针对枯草芽胞杆菌的密码子偏好性，优化上述六个密码子α-葡萄糖苷酶编码基因核酸序列，优化的过程中同时消除原有基因中已有的SmaI和EcoRI位点同时不形成新的上述两个酶切位点。全合成六个α-葡萄糖苷酶编码基因agAbs、agBbs、agCbs、agDbs、agEbs和agFbs克隆入pHY-P43-Samy质粒的SmaI和EcoRI位点。按照化学转化的方法获得对应的重组枯草芽胞杆菌AGabs、AGbbs、AGcbs、AGdbs、AGebs和AGfbs。采用发酵培养基（酵母膏3～5%，蛋白胨3.8～6.2%，葡萄糖10～30%，乳糖1~5%，pH 7.0）好氧发酵方法制备相应的α-葡萄糖苷酶酶液AGAbs、AGBbs、AGCbs、AGDbs、AGEbs和AGFbs。测定所得的酶活分别为296 U/mL、315 U/mL、350 U/mL、376 U/mL、388 U/mL和368 U/mL。

实施例3. α-葡萄糖苷酶高产菌种的获得

然后以六个α-葡萄糖苷酶编码基因agAbs、agBbs、agCbs、agDbs、agEbs和agFbs混合作为模板采用长引物agXtemP1和agXtemP2，扩增获得agXX基因克隆入pHY-P43-Samy质粒中，获得重组质粒pHY-P43-Samy-agXX，转化入枯草芽胞杆菌1A717中，获得的重组枯草芽胞杆菌1A717（pHY-P43-Samy-agXX），经摇瓶发酵制备酶液并通过测定α-葡萄糖苷酶酶活获得最优的转化子。其中筛选获得的4个最优重组枯草芽胞杆菌1A717-agX06、1A717-agX17、1A717-agX45和1A717-agX58的基础酶学性质如图2和图3所示，最高酶活分别为430 U/mL、510 U/mL、500 U/mL和680 U/mL。

其中agXtemP1：ATGGTTAAACTGCCCTTTAACATCCAAATGTTTTCTACTTCCATTACGG；

agXtemP2：TTACCATTCAAACGTTAGTTGAAACGAACGTAACGAGAGTCAACATCCCA。

实施例4. α-葡萄糖苷酶生产菌株1A717-agX58发酵工艺的建立

进一步将重组枯草芽胞杆菌1A717-agX58在25 L全自动发酵罐中进行发酵试验，发酵培养基为玉米浆粉5～7%，豆粕6～9%，葡萄糖10～30%，乳糖1~5%，pH 7.0；工作发酵体积12 L；发酵温度42 ± 1℃；发酵过程中维持溶氧为20%以上；发酵12 h后，通过流加50%葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5～10 g/L；发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为7.0；发酵时间为50～80 h。产酶水平达到760 U/mL。

实施例5. 30 m³发酵体系下α-葡萄糖苷酶的制备

进一步将重组枯草芽胞杆菌1A717-agX58按照实施例4的工艺调整为30 m³发酵体系，发酵培养基为玉米浆粉5～7%，豆粕6～9%，葡萄糖10～30%，乳糖1~5%，pH 7.0。分别完成种子培养，接种一级种子罐，移种二级种子罐，主发酵罐移种等操作后，培养菌体，经补料生长阶段后产酶发酵70～90 h后发酵结束。产酶水平达到830 U/mL。发酵液经板框过滤除去菌体，超滤膜浓缩酶液至合适浓度，添加辅助制剂后精滤制备α-葡萄糖苷酶液体成品。或添加适量食品级淀粉后喷雾干燥制备粉末剂型α-葡萄糖苷酶成品。

实施例6 30 m³制糖体系下大宗制备低聚异麦芽糖

淀粉液化和糖化：加入4.5t淀粉到装有10m³水的发酵罐中（边加入淀粉，边搅拌），将淀粉乳搅拌均匀后加入一定量的水，在发酵罐中定容到18m³，调节pH至6.0。将淀粉乳加热至40~50℃，加入耐高温α-淀粉酶450L（40000 U/ml），继续加热淀粉醪液至沸腾，即完成液化。将上述液化后的醪液冷却至50℃~60℃，加入普鲁兰酶40.5L（1000 U/ml）、β-淀粉酶3.2L（70万U/ml）、实施例5制备的α-葡萄糖苷酶5.65kg，维持反应温度在50℃~60℃，反应13h即可得到低聚异麦芽糖（IG2+P+IG3）占干物质含量为48%~60%的糖浆，见图4。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建福大百特生物科技有限公司

<120> 一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法

<130> 17

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2911

<212> DNA

<213> agX58

<400> 1

atggttaaac ttacacatct tcttgctcgt gcttggcttg ttcctcttgc ttacggcgct 60

tctcaatctc ttctttctac aacagctcct tctcaacctc aattcacaat ccctgcttct 120

gctgatgttg gcgctcaact tatcgctaac atcgatgatc ctcaagcgct ttgcccttct 180

tacaaatctc ctcaagttga tatgggctac gatatcgctg attactactc tatcgctgat 240

gaatacggca cagctggccg tccttgcaac gtttacggca cagatgttga atctcttaca 300

ctttctgttg aataccaaga ttctgatcgt cttaacatcc aaatccttcc tacacatgtt 360

gattctacaa acgcttcttg gtacttcctt tctgaaaacc ttgttcctcg tcctaaagct 420

tctcttaacg cttctgtttc tcaatctgat cttttcgttt cttggtctaa cgaaccttct 480

ttcaacttca aagttatccg taaagctaca ggcgatgctc ttttctctac agaaggcaca 540

gttcttgttt acgaaaacca attcatcgaa ttcgttacag ctcttcctga agaatacaac 600

tacgtttctt ctgatggccg tgttttctac cttgatgaaa acgatacagc ttacgctgtt 660

ttcgatttcc aacgttctga tgctgttaca gttcgttacg attctctttc tgttcatggc 720

catcttatgc aagctgatac aatgcttgat gctatcacaa tgcttacaga atacacaggc 780

cgtatgccta cacttcctga atgggttgat catggcgctc ttcttggcat ccaaggcggc 840

caagaaaaag ttaaccgtat cgttaaacaa ggcttcgaac atgattgccc tgttgctggc 900

gtttggcttc aagattggtc tggcacacat cttcaatctg ctccttacgg caacatgaac 960

atctctcgtc tttggtggaa ctgggaatct gatataaaca aaactactac gataaaggca 1020

tctggtggac aacagatatc ggcggcttcc atggcggcga tccttctgat cctgctttcc 1080

gtgaactttt cacacgttgg ttccaatggg gcgctttctg ccctgttatg cgtcttcatg 1140

gcgatcgtga acctaaacct gaaaaccgtc ctacagattc tggctctgat aacgaaatct 1200

catgaatctg gccgttacta cgttcctatc gttgatgctg ctctttacat ccctaaccct 1260

gaaaacgctt ctgatgctta cgctacatac gatcgtggcg ctgctgatga cctgttatgc 1320

gtacactttt ctacgaattt cctgctgata aaaaagcttg ggatgttgaa acagaacatc 1380

ttttcggctc taaatacctt gttgttcctg ttttcgaagc tggcaaacgt tctgttgaag 1440

tttaccttcc tgctggcgct tcttggaaag tttggggcca agaagatgtt atccatgaag 1500

gcggcaaaga aatccaagtt gattgccctc cctgctcatc cttctttcct tcttcctggc 1560

gaacctggcg atatcatcta cgattaccct gaagctttca acatcacaaa cgctacagaa 1620

gctgcttctg cttctgctgg cgcttcttct caagctgctg ctacagctac aacaacatct 1680

acatctgttt cttaccttcg tacaacacct acacctggcg ttcgtaacgt tgaacatcct 1740

ccttacgtta tcaaccatga tcaagaaggc catgatcttt ctgttcatgc tgtttctcct 1800

aacgctacac atgttgatgg cgttgaagaa tacgatgttc atggccttta cggccatcaa 1860

ggccttaacg ctacatacca aggccttctt gaagtttggt ctcataaacg tcgtcctttc 1920

atcatcggcc gttctacatt cgctggctct ggcaaatggg ctggccattg gggcggcgat 1980

aactactcta aatggtggtc tatgtactac tctatctctc aagctctttc tttctctctt 2040

ttcggcatcc ctatgttcgg cgctgataca tgcggcttca acggcaactc tgatgaagaa 2100

ctttgcaacc gttggatgca actttctgct ttcttccctt tctaccgtaa ccataacgaa 2160

ctttctacaa tccctcaaga accttaccgt tgggcttctg ttatcgaagc tacaaaatct 2220

cgttcgtttc aacgctacgc tatccttcct tacttctaca cacttttcga tcttgctcat 2280

acaacaggct ctacagttat gcgtgctctt tcttgggaat tccctaacga tcctacactt 2340

gctgctgttg aaacacaatt catggttggc cctgctatca tggttgttcc tgttcttgaa 2400

cctcttgtta acacagttaa aggcgttttc cctggcgttg gccatggcga agtttggtac 2460

gattggtaca cacaagctgc tgttgatgct aaacctggcg ttaacacaac aatctctgct 2520

cctcttggcc atatccctgt ttacgttcgt ggcggcaaca tccttcctat gcaagaacct 2580

gctcttacaa cacgtgaagc tcgtcaaaca ccttgggctc ttcttgctgc tcttggctct 2640

aacggcacag cttctggcca actttacctt gatgatggcg aatctatcta ccctaacgct 2700

acacttcatg ttgatttcac agcttctcgt tcttctcttc gttcttctgc tcaaggccgt 2760

tggaaagaac gtaaccctct tgctaacgtt acagttcttg gcgttaacaa agaaccttct 2820

gctgttacac ttaacggcca agctgttttc cctggctctg ttacatacaa ctctacatct 2880

caagttcttt tcgttggcgg ccttcaaata a 2911

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> agXtemP1

<400> 2

atggttaaac tgccctttaa catccaaatg ttttctactt ccattacgg 49

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> agXtemP2

<400> 3

ttaccattca aacgttagtt gaaacgaacg taacgagagt caacatccca 50

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Samy1

<400> 4

cggggtacca aaaaatcaaa taaggag 27

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Samy2

<400> 5

cgcggatcct gtaagctcat tcgatttgtt 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> agA1

<400> 6

gtttcctcta gtcctaccaa gcga 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> agA2

<400> 7

ctaactacaa cacccaacga cacct 25

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> agB1

<400> 8

gatagttctt ctttcagagg ttgagtgtc 29

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> agB2

<400> 9

ctaaaactca atccgccatg tctttcca 28

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> agC1

<400> 10

cccagctata aatcgggact ga 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> agC2

<400> 11

tcacgcatac agcaccgttc c 21

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> agD1

<400> 12

gtaatagctg ttccattctc atcaag 26

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> agD2

<400> 13

ctaccattcc aatacccagt tttcc 25

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> agE1

<400> 14

cagaaaacgc ccaaaacacc a 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> agE2

<400> 15

tcaagcctcc accaaaagaa ca 22

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> agF1

<400> 16

cctaattgga ctgcatctgt tcaac 25

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> agF2

<400> 17

tcagaccctg acaaataccg gc 22

Claims (1)

1. 一种α-葡萄糖苷酶编码基因，其特征在于：所述α-葡萄糖苷酶编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

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