Одноклеточные водоросли — перспективная платформа для производства противораковых иммунотоксинов

Рис. 1. Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii. Диаметр клетки примерно 10 мкм. Единственный зеленый хлоропласт занимает почти весь объем клетки. Рисунок с сайта Прикладных исследований в области ботаники в Германии

Одноклеточные водоросли могут стать экономически эффективной системой для производства противораковых иммунотоксинов. В отличие от других клеток эукариот, клетки водорослей быстро размножаются на дешевых питательных средах, а хлоропласты водорослей, в отличие от бактерий, способны не только синтезировать чужеродные белки, но и осуществлять сложные постсинтетические процессы, необходимые для активации белков. Гены, кодирующие чужеродный белок, встраивают в геном хлоропластов водорослей, после чего те начинают синтезировать белок иммунотоксина в больших количествах.

Традиционные химио- или радиотерапия, применяемые для лечения рака, обладают принципиальным недостатком. Они преимущественно убивают раковые клетки, но в той или иной мере подавляют и нормальные.

Известно, что многие клетки злокачественных опухолей или злокачественные клетки кровеносной системы имеют на поверхности специфические белки. Поэтому с помощью антител против этих белков можно доставлять поражающие агенты именно к этим клеткам, что сейчас активно используется в разработке специфичных противоопухолевых препаратов. Антитела (иммуноглобулины) являются важнейшим фактором иммунитета. Они распознают чужеродные для организма агенты — бактерии, вирусы, белки и др. Антитела могут инактивировать эти агенты просто путем связывания или запускать иммунный ответ, например систему комплемента — комплекса протеолитических ферментов.

Одним из путей исследований по адресному поражению раковых клеток является разработка методами генной инженерии иммунотоксинов — антител против белков, специфичных для этих клеток, с прикрепленным к антителам химическим или природным токсичным агентом. Антитело должно «узнать» раковую клетку, а токсичный агент — убить ее.

Идея высказана давно, но практическая реализация оказалась затруднительной из-за сложности задачи и отсутствия экономически эффективных технологий для изготовления таких весьма сложных комплексов. Так, рекомбинантный иммунотоксин — фрагмент антитела с присоединенным к нему токсином, — можно производить в клетках бактерий (в основном для этого используется кишечная палочка Esherichia coli; чтобы бактерии продуцировли чужеродные белки, в них вводят гены этих белков при помощи плазмид). Однако бактерии не могут осуществлять многие постсинтетические процессы, необходимые для обеспечения биологической активности белков эукариот: они неспособны формировать правильные дисульфидные связи, правильно укладывать синтезированные полипептидные цепи чужеродных белков, что необходимо для их активности (иначе белки не смогут выполнять свою функцию). Рекомбинантный иммунотоксин в клетках бактерий получается в виде неактивного нерастворимого агрегата. Чтобы этот белок активировать, приходится его выделять, денатурировать (снова его разворачивать) и укладывать белковые цепи искусственно.

В культурах клеток эукариот эта проблема формирования правильной трехмерной структуры чужеродного белка решается, но токсины будут отравлять клетки-продуценты (клетки, которые производят белок).

Тем не менее эти трудности, по крайней мере частично, удается преодолеть обходным путем, если исключить прямой контакт культуры клеток-продуцентов с токсином. Например, активные антитела против специфичного для некоторых лимфом (злокачественного перерождения лимфоцитов) белка клеточной мембраны CD30 изготовляют в культурах клеток млекопитающих — CHO-клетках хомячков (см. CHO cells). Их очищают и связывают с химическим соединением ауристатином Е (Monomethyl auristatin E), подавляющим деление эукариотических клеток. Показана высокая активность и избирательность действия этого препарата (Brentuximab vedotin) против злокачественных клеток. Он уже разрешен в США для применения в клинике по крайней мере против двух форм лимфомы. Однако, вследствие больших затрат на разработку, сложности и дороговизны производства, цена Brentuximab vedotin оказалась поистине астрономической: курс лечения будет стоить примерно 100 тысяч долларов.

Биотехнологи из Калифорнийского университета в Сан-Диего предлагают экономично решить проблему изготовления противораковых иммунотоксинов с помощью неприхотливых зеленых одноклеточных водорослей Chlamydomonas reinhardtii (рис. 1). Этот объект хорошо изучен и широко используется в различных теоретических и прикладных исследованиях. Например, C. reinhardtii в определенных условиях продуцирует водород, и рассматривается как возможный продуцент биотоплива. Уже определены нуклеотидные последовательности 17 хромосом ядерного генома этой водоросли, а также геномов митохондрий и хлоропласта (митохондрии и хлоропласты, возможно, были когда-то симбиотическими бактериями внутри первых клеток эукариот — так ученые объясняют наличие отдельного генома у этих органоидов, похожего больше на геном бактерий, чем на геном эукариот; см. Симбиогенез).

C. reinhardtii принадлежит к низшим эукариотам, и его ядерно-цитоплазматические механизмы для производства противораковых иммунотоксинов непригодны: токсин будет их подавлять. Но механизмы синтеза белков хлоропласта, который занимает примерно 70% объема клетки, устроены подобно бактериальным, по прокариотному типу, и токсины, губительные для эукариот, но не прокариот, на них не действуют. В то же время замечательной особенностью хлоропласта является то, что он, в отличие от бактерий, имеет все необходимые механизмы для сборки сложных белковых комплексов. Поэтому они, с одной стороны, нечувствительны к ряду белковых токсинов, летальных для клеток эукариот, а с другой стороны, могут продуцировать биологически активные иммунотоксины.

Рис. 2. Рекомбинантная структура для синтеза иммунотоксинов в хлоропластах C. reinhardtii. Ген иммунотоксина снабжен регуляторными элементами для экспрессии в хлоропластах. Он соединен с геном устойчивости к канамицину (aphA6), необходимым для отбора клеток, в которые встроилась рекомбинантная структура. Структура фланкирована (обрамлена) участками генома хлоропласта, за счет которых осуществляется интеграция в этот геном.
Обозначения: 5'UTR — некодирующая область на 5'-конце ДНК (перед началом гена); 3'UTR — некодирующая область на 3'-конце ДНК (после конца гена); psbA — ген хлоропластов, вместо которого вставили ген иммунотоксина (от гена psbA остались промотор — сигнал начала синтеза белка — и 3'UTR); atpA — ген хлоропластов, от которого в данной конструкции используется промотор; rbcL — хлоропластный ген большой субъединицы фермента рибулозобифосфат-карбоксилазы, 3'UTR которого используется в конструкции; 5S RNA и 23S RNA — гены рибосомных РНК. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Авторы сконструировали рекомбинантную структуру (рис. 2), кодирующую пептидные цепи антитела, узнающего мембранный белок CD22 В-клеток лимфомы, связанные с доменами II и III белкового экзотоксина А синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa. Токсин подавляет работу рибосом (биосинтез белка) эукариотических клеток, но не рибосом клеток прокариот. Чтобы рекомбинантный белок-иммунотоксин (рис. 3) мог синтезироваться в хлоропластах при помощи этой конструкции, её снабдили необходимыми для этого элементами (специфическим промотором) и встроили в геном хлоропласта по механизму гомологичной рекомбинации (части конструкции были похожи на геном хлоропласта, что облегчало ее встраивание). Полученные штаммы C. reinhardtii продуцировали белки ожидаемого молекулярного веса с ферментативной активностью, свойственной экзотоксину А. В культурах клеток иммунотоксин эффективно подавлял лимфомные В-клетки, но не лейкемические Т-клетки, не имеющие белка CD22. И наконец, иммунотоксин блокировал рост опухолей у мышей, которым были введены лимфомные В-клетки человека.

Рис. 3. Структуры белков-иммунотоксинов, синтезированных в хлоропластах C. reinhardtii. А — фрагмент антитела (вариабельная область), узнающий белок CD22. В — иммунотоксин: фрагмент антитела, соединенный с биологически активными доменами II и III белкового экзотоксина А синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa. С — усовершенствованный иммунотоксин с повышенной активностью и устойчивостью: димер структуры В, в который дополнительно встроена константная область антитела. Рисунок из обсуждаемой статьи в PNAS

Разумеется, прежде чем полученные в хлоропластах иммунотоксины будут допущены в клиническую практику, требуется доказать их эффективность и отсутствие неприемлемых побочных эффектов. В частности, можно ожидать, что иммунотоксин будет поражать не только лимфомные В-клетки, но и нормальные В-лимфоциты. Однако уже проведенные испытания аналогичного препарата Brentuximab vedotin позволяют надеяться, что такой побочный эффект будет приемлемым.

Таким образом, хлоропласты водорослей представляются в высшей степени перспективными для производства противораковых иммунотоксинов. Бактерии не могут производить активные сложные белковые комплексы. Прямой синтез иммунотоксинов в культурах клеток млекопитающих невозможен, так как токсины отравляют эти клетки. Высшие растения, в хлоропластах (но не в цитоплазме) которых, в принципе, также можно производить иммунотоксины, растут медленее, и риск их неконтролируемого распространения гораздо выше. Напротив, C. reinhardtii и им подобные быстро размножаются, их культивируют в закрытых реакторах на дешевых средах — растворах простых минеральных солей, что ценно как с экономической точки зрения, так и для защиты окружающей среды. Таким образом, хлоропласты водорослей открывают новый путь для создания противораковых средств следующего поколения.

Источник: Miller Tran, Christina Van, Daniel J. Barrera, Pär L. Pettersson, Carlos D. Peinado, Jack Bui, and Stephen P. Mayfield. Production of unique immunotoxin cancer therapeutics in algal chloroplasts // Proc Natl Acad Sci USA. 2013. V. 110. Р. E15–22.

Вячеслав Калинин