Молочные пропионовокислые бактерии в профилактике и терапии рака

Пропионовокислые бактерии в профилактике и лечении рака желудка и колоректальной карциномы

См. отдельно:

Исследование роли молочных пропионибактерий P. freudenreichii в профилактике колоректального рака

Содержание:

Предисловие от редактора

• Аннотация
• Вступление
• Цель исследования
• Результаты исследования
• Пропионибактерии убивают клеточные линии колоректального рака
• Рис. 1. SCFAs опосредуют вызванную пропионибактериями гибель клеток
• Рис. 2. Влияние чистого ацетата и пропионата на жизнеспособность клеток HT29
• Пропионибактериальные SCFA вызывают апоптоз клеток карциномы толстой кишки
• Рис.3. SCFA, продуцируемый пропионибактериями, индуцирует апоптоз в клетках HT29 и Caco2.
• Пропионибактериальный SCFA-индуцированный апоптоз включает митохондриальные изменения, которые противодействуют Bcl-2 и ANT-нацеленному вирусному белку
• Рис.4. Влияние пропионибактериальных супернатантов и SCFA на параметры митохондрий, связанные с апоптозом
• Пропионибактериальные SCFA действуют на очищенные митохондрии, а также на ANT, восстановленные в протеолипосомы
• Рис.5. Пропионибактериальные SCFAs запускают набухание большой амплитуды в изолированных митохондриях
• Рис.6. Влияние SCFAs на ANT-содержащие липосомы
• Обсуждения
• Сокращения
• Дополнение для профильных специалистов и врачей

 

• Резюме
• Введение
• Диета модулирует риск развития рака желудка
• Короткоцепочечные жирные кислоты индуцируют апоптоз раковых клеток
• Propionibacteriumfreudenreichii может способствовать апоптотическому истощению раковых клеток пищеварительного тракта
• В этом контексте в качестве средства доставки пропионибактерий оценивали сквашенное молоко
• Результатs иследования
• P. freudenreichii-ферментированное молоко убивает клетки рака желудка и толстой кишки человека
• Рисунок 1. P. freudenreichii-ферментированное молоко убивает человеческие колоректальные и желудочные раковые клетки
• Ферментированное P. freudenreichii молоко индуцирует типичные признаки апоптоза в клетках рака желудка человека
• Рисунок 2. Ультрафильтрат ферментированного P. freudenreichii молока индуцирует типичные ядерные метки апоптоза в раковых клетках желудка человека
• Рисунок 3. Ультрафильтрат ферментированного P. freudenreichii молока индуцирует воздействие фосфатидилсерина на наружную створку плазматической мембраны в раковых клетках желудка человека
• Рисунок 4. Ультрафильтрат ферментированного P. freudenreichii молока индуцирует митохондриальные метки апоптоза в раковых клетках желудка человека
• P. freudenreichii ферментированное молоко активирует каспазы
• Рисунок 5. Ультрафильтрат ферментированного P. freudenreichii молока активирует каспазы в клетках рака желудка человека
• Ферментированное P. freudenreichii молоко повышает цитотоксичность камптотецина
• Рис. 6. Ферментированное P. freudenreichii молоко усиливает цитотоксичность камптотецина в раковых клетках желудка человека
• Обсуждение
• Вспомогательная информация
• Рис. S1. Популяция пропионибактерий и производство SCFAs 12-ю молочными штаммами пропионибактерий в ферментированном молоке.
• Рис. S2. Кинетика гибели клеток, индуцированной пропионибактериальным метаболитом (А) или камптотецином (Б), определяется тремя методами.
• Рис. S3. Временной ход, ведущий к 50% гибели клеток HGT-1 (T1/2) ультрафильтратом заквашенного молока или заквашенным молоком.  
• Рис. S4. Камптотецин индуцирует типичные ядерные признаки апоптоза в клетках рака желудка человека
• Рис. S5. Камптотецин индуцирует воздействие фосфатидилсерина на наружный лист плазматической мембраны в раковых клетках желудка человека
• Рис. S6. ROS-акцептор TEMPOL снижает накопление пропионибактериальных метаболитов анион-супероксида (O₂^-).
• Таблица S1. Штаммы молочных пропионовокислых бактерий и их происхождение
• Таблица S2. Молочные пропионибактерии, ферментирующие молоко, вызывают апоптоз в колоректальных клетках человека HT-29.
• Литература

 ПРЕДИСЛОВИЕ ОТ РЕДАКТОРА

В данном разделе представлены результаты 2-х уникальных исследований французских ученых, одно из которых было выполнено специалистами из Национального института здравоохранения и медицинских исследований Франции (INSERM), а другое учеными из Института онкологии Гюстава Русси (Institut Gustave Roussy) - одного из ведущих мировых онкологических научно-исследовательских институтов и главного европейского онкологического центра. Речь идет об использовании в терапии раковых заболеваний пищеварительного тракта дружественных нам микроорганизмов - пробиотических молочных пропионовокислых бактерий P. freudenreichii ssp. Как выяснилось из работ, анаэробные пропионибактерии являются эффективными разрушителями раковых клеток желудка и колоректальной карциномы.

Интересным является тот факт, что в исследовании специалистов из INSERM, в отличие от группы ученых из Института Гюстава Русси, в качестве "транспорта" по доставе пробиотиков и их метаболитов к раковым клеткам использовался  кисломолочный продукт, ферментированный исключительно (!) пропионовокислыми бактериями (ПКБ). Таким образом было исключено воздействие на ПКБ других микроорганизмов, а соответственно и на качество выходного продукта. В настоящее время такая возможность ферментации молоко исключительно с помощью ПКБ (без стимуляторов роста) имеется не везде, т.к. ПКБ имеют слабую энергию кислотообразования и прохо развиваются в молоке, а потому часто используются совместно с заквасочными культурами (термофильным стрептококком или кефирной закваской). Исключение составляют бакконцентраты ПКБ от компании ООО "Пропионикс", в которых культуры P. freudenreichii ssp. имеют высокую бета-галактозидазную активность, а потому они ферментируют молоко "без посторонней помощи". Что касается французской технологии получения к/м продукта, ферментированного исключительно ПКБ, то видимо решение было найдено путем подготовки молочного сырья (как пример, использование лактата - мнение ред.). Так или иначе, наш ресурс предназначен не только для специалистов и студентов профильных специальностей, а поэтому, для того, чтобы лучше понять тему, рекомендуем сначала ознакомиться с понятием АПОПТОЗ. Именно благодаря данному механизму и разрушаются раковые клетки, чему активно способствуют наши пропионовокислые "помощники". Об апоптозе раковых клеток краткую информацию см. в одноименном подразделе "Апоптоз раковых клеток". Там же есть видео, очень понятно объясняющее механизм апоптоза (программируемой гибели клеток). Если же все понятно, то можно легко ознакомиться с предложенным материалом.

---

Пропионибактерии вызывают апоптоз клеток колоректальной карциномы через короткоцепочечные жирные кислоты, действующие на митохондрии

Аннотация

Род Propionibacterium состоит из молочных и кожных бактерий, которые производят короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), главным образом пропионат и ацетат, путем ферментации. Здесь мы показываем, что P. freudenreichii и acidipropionici, два вида, которые могут выживать в кишечнике человека, могут уничтожить две клеточные линии колоректальной карциномы человека путем апоптоза. Пропионат и ацетат были идентифицированы как основные цитотоксические компоненты, выделяемые бактериями. Супернатанты бактериальной культуры, а также чистые SCFAs вызывали типичные признаки апоптоза, включая потерю митохондриального трансмембранного потенциала, образование активных форм кислорода, процессинг каспазы-3 и конденсацию ядерного хроматина. Онкопротеин Bcl-2, который, как известно, предотвращает апоптоз с помощью митохондриальных эффектов, и кодируемый цитомегаловирусом белок vMIA, который ингибирует апоптоз и взаимодействует с митохондриальным транслокатором аденинуклеотидных нуклеотидов (ANT), оба ингибируют гибель клеток, вызванную пропионибактериальным SCFAs, предполагая, что митохондрии и ANT участвуют в пути гибели клеток. Соответственно, пропионат и ацетат вызывали набухание митохондрий при добавлении в очищенные митохондрии in vitro. Более того, они специфически проникают в протеолипосомы, содержащие ANT, что указывает на то, что ANT может быть критической мишенью при апоптозе, вызванном SCFAs. Мы предполагаем, что пропионибактерии могут представлять собой пробиотики, эффективные для профилактики рака пищеварительного тракта, благодаря их способности вызывать апоптоз-индуцированные SCFAs.

Вступление

Онкогенез определяется сочетанием генетических факторов и факторов окружающей среды, включая радиацию, химические канцерогены и диету. Действительно, роль диеты в развитии рака решительно подтверждается эпидемиологическими исследованиями, в частности, в случае рака желудочно-кишечного тракта. Основное влияние привычек питания на распространенность рака толстой кишки вызвало усилия по разработке оптимальной диеты и / или для создания пищевых добавок, специально снижающих риск развития рака. Пробиотики - это непатогенные микроорганизмы, которые при попадании в организм оказывают положительное влияние на здоровье или физиологию организма-хозяина. Они могут прямо или косвенно влиять на физиологию кишечника путем регуляции эндогенной микрофлоры. Среди различных диетических бактерий пропионибактерии образуют род, который содержится в определенных молочных продуктах, таких как сыр швейцарского типа. Метаболизм пропионибактерий зависит от анаэробного превращения углеводов и молочной кислоты в короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs), в частности, пропионат и ацетат.³ Ранее было показано, что бутират (который вырабатывается эндогенными бактериями, не принадлежащими к роду Propionibacterium) ^4,5 индуцирует апоптоз в раковых клетках толстой кишки, но не в нормальных клетках.^5,6,7,8 Таким образом, с целью определения новой профилактики рака на основе диетической добавки пробиотиков мы исследовали цитотоксический потенциал пропионибактерий на клетках рака толстой кишки человека.

В ходе апоптоза митохондриальные изменения состоят, прежде всего, в увеличении проницаемости мембран митохондрий, по крайней мере частично, из-за раскрытия комплекса пор с переходной проницаемостью (PTPC - permeability transition pore complex). PTPC представляет собой белковый комплекс, расположенный в месте контакта между двумя митохондриальными мембранами. Он состоит из нескольких белков, включая гексокиназу (цитозоль), порин, также называемый напряженно-зависимым анионным каналом (VDAC, основной белок в наружной мембране), периферический бензодиазепиновый рецептор (PBR, наружная мембрана), ANT (основной белок во внутренней мембране) и циклофилин D (матрикс). Недавно было показано, что PTPC участвует в апоптотическом процессе, индуцированном различными проапоптотическими сигналами, такими как проапоптотические члены семейства Bcl-2, ^10,11 вирусных белков, ^12,13 химиотерапевтических агентов^14,15,16 и липиды, такие как пальмитат¹⁷ и ганглиозид GD3.¹⁸. При индукции апоптоза PTPC-белок ANT может образовывать большие неспецифические поры, что позволяет происходить диффузии молекул до 1500 Да на внутренней митохондриальной мембране. Это приводит к диссипации внутреннего трансмембранного потенциала (ΔΨm), усиленной генерации активных форм кислорода (АФК), коллоидосмотическому набуханию митохондриального матрикса и проницаемости внешней мембраны с последовательным выделением апоптогенных белков из межмембранного пространства в цитоплазму .^19,20 Все эти события предотвращаются онкопротеинами из семейства Bcl-2, которые, как было показано, взаимодействуют с компонентами PTPC, в частности ANT^10,11,21 и VDAC.²²

Прим. ред.: ΔΨm (мембранный потенциал митохондрий) имеет решающее значение для поддержания физиологической функции дыхательной цепи для выработки АТФ; открытие митохондриальной проницаемости переходной поры (MPTP) приводит к коллапсу ΔΨm и последующему высвобождению цитохрома с в цитозоль.

Следует отметить, что большинство противораковых агентов, хотя и цитотоксические, не оказывают прямого воздействия на митохондрии. Скорее, они вызывают пути передачи сигнала, которые косвенно влияют на митохондрии. Известные примеры включают p53-индуцированную активацию белков, действующих на митохондрии (например, антагонист Bcl-2 Bax, p53-Ap1, пролиноксидаза)²³, а также генерацию вторичных мессенджеров, включая Ca^{2 +}, ганглиозид GD3, NO и ROS.¹⁵ Недавно было обнаружено, что ряд экспериментальных химиотерапевтических агентов непосредственно влияет на митохондрии. Это относится к бетулиновой кислоте, ^24,25 лонидамину, ²⁶ арсениту, ²⁷ 6[3-адамантил-4-гидроксифенил] -2-нафталинкарбоновой кислоте (CD437), ²⁷ 2-хлор-2'-деоксиаденозину, 2-хлор-2 ' -арафтородезоксиаденозину, ²⁹ вертепорфину¹⁶ и МТ-21.³⁰

Целью настоящего исследования было определить, могут ли пропионибактерии убивать раковые клетки толстой кишки. Для этой цели мы выбрали три штамма пропионибактерий, отобранных по их устойчивости к пищеварительным стрессам, ^31,32, а именно штамм Propionibacterium acidipropionici CNRZ80, P. freudenreichii subsp. штамм freudenreichii ITG18 и P. freudenreichii subsp. штамм shermanii SI41, являющийся коммерчески доступным пробиотиком SI41. Наши данные показывают, что эти штаммы убивают линии раковых клеток человека, таких как клетки HeLa, HT29 и Caco2, по-видимому, через SCFAs. Мы исследовали механизм, посредством которого SCFAs индуцируют апоптоз и предоставляют доказательства того, что они непосредственно воздействуют на митохондрии, проникая в их мембраны.

Результаты

Пропионибактерии P. freudenreichii ssp. убивают клеточные линии колоректального рака

"Разрушители" раковых клеток - Биоконцентраты с ПКБ P. freudenreichii subsp.

---

Чтобы исследовать цитотоксический потенциал различных штаммов и видов молочных пропионибактерий, мы совместно культивировали клетки колоректальной карциномы НТ29 со штаммом Propionibacterium acidipropionici штамм CNRZ80, P. freudenreichii subsp. freudenreichii штамм ITG18, и P. freudenreichii subsp. shermanii штамм SI41. Все эти штаммы вызывали гибель клеток. Цитоцидный эффект пропионибактерий нельзя объяснить ни бактериальной инвазией клеток-хозяев, ни поверхностными взаимодействиями, так как тепловая инактивация устраняет гибель клеток. Скорее, супернатантов (SN) пропионибактерий было достаточно для уничтожения клеток карциномы ободочной кишки HT29 (рис.1А), клеток Caco 2 (не показаны) и клеток лимфомы Jurkat (не показаны), что позволяет предположить, что убийство раковых клеток было связано с присутствием растворимых факторов, содержащихся в среде. В качестве контроля специфичности бактериального рода также оценивали эффект Escherichia coli SN. Соответственно, E.coli SN не индуцирует гибель клеток HT29. Цитотоксические эффекты были быстрыми: половинное максимальное уничтожение SN, полученным из штаммов CNRZ80 или ITG18, произошло в течение 3 часов, а поражение SN, полученное из SI41, произошло в течение 24 часов (рис.1A). Лиофилизация устраняет цитотоксический эффект SN от CNRZ80 (рис.1А), подтверждая, что летальное соединение, содержащееся в SN, было летучим. Мы провели HPLS-анализ SN, чтобы обнаружить присутствие летучих молекул-кандидатов. Ацетат и пропионат были идентифицированы как основные SCFAs в SN штаммов CNRZ80, ITG18 и SI41 (рис.1C). Обе жирные кислоты были частично удалены путем лиофилизации SN штамма CNRZ80 (рис.1C). В этих условиях образование бутирата невозможно. Соотношения пропионат / ацетат находились в диапазоне от 2,5 до 2,9, как и ожидалось для пропионовокислых бактерий, которые обычно производят больше пропионата, чем ацетата.³ Супернатант SN-CNRZ80 содержал больше ацетата (16 mM) и пропионата (39,5 mM), чем SN-ITG18 (12,5 и 36,3 mM соответственно), а также больше, чем у SN-SI41 (9,3 и 26,1 mM) (рис.1B), что коррелирует с цитотоксическим потенциалом супернатантов (рис.1C). Затем мы проверили цитотоксичность пропионата и ацетата и обнаружили, что эти соединения убивают клетки НТ-29 с эффективной дозой ED₅₀, равной 11 и 20 mM соответственно (рис.2). Взятые вместе, эти данные указывают на то, что пропионибактерии эффективно убивают клетки карциномы толстой кишки, по крайней мере частично, благодаря их специфической способности продуцировать две SCFAs, пропионат и ацетат.

Рис. 1. SCFAs опосредуют вызванную пропионибактериями гибель клеток. (A) Влияние пропионибактерий на клетки рака толстой кишки HT29. 1^.10⁶ клеток НТ29 совместно культивировали с супернатантами различных штаммов пропионибактерий, а именно P. acidipropionici CNRZ80, P. freudenreichii subsp. фрейденрейчи ITG18, или P. freudenreichii subsp.shermanii SI41. В качестве контроля культуры клеток инокулировали убитым нагреванием штаммом CNRZ80 или лиофилизированным супернатантом штамма CNRZ80. Жизнеспособность клеток определяли после разных периодов культивирования. Этот эксперимент был воспроизведен три раза. (B) Хроматографический анализ SCFA в супернатантах (SN) культуры DMEM (разведенных в среде DMEM– ред.). DMEM инокулировали штаммом CNRZ80, ITG18 или SI41. После выращивания супернатанты готовили центрифугированием до хроматографического количественного определения ацетата (А) и пропионата (Р) в сравнении с молекулярными стандартами, как описано в разделе «Материалы и методы». В качестве контроля SN-CNRZ80 экстенсивно лиофилизировали и восстанавливали перед анализом в тех же условиях. (C) Состав и активность пропионибактериальных супернатантов. Концентрацию жирных кислот с короткой цепью анализировали с помощью ВЭЖХ-хроматографии, как в B, и определяли временной ход, приводящий к 50% гибели клеток HT29 (t_1/2), как в A.

Рис. 2. Влияние чистого ацетата и пропионата на жизнеспособность клеток HT29.  1^.10⁶ клеток HT29 оставались необработанными (Co. - контроль) или были обработаны с различными концентрациями пропионата или ацетата. Процент выживших клеток определяли через 48 ч культивирования путем исключения Трипанового синего. Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов ± S.E.M.

Пропионибактериальные SCFA вызывают апоптоз клеток карциномы толстой кишки

Апоптоз протекает через серию биохимических событий, отличных от тех, которые происходят во время некроза. Например, апоптоз, но не некроз, обычно включает активацию каспаз и ядерные изменения, такие как конденсация хроматина. Для характеристики пропионибактериальной SCFA-индуцированной гибели клеток обработку каспазой 3 анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга SN и обработанных SCFA клеток HT29 и Caco2 (рис.3A).

Прим. ред.: Иммуноблоттинг - высокочувстви­тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. (Иммуноферментного или радиоиммунного анализа)

Бактериальные SN-ITG18 и -CNRZ80 (данные не показаны), а также смесь пропионата и ацетата в молярном соотношении [2:1] вызывали расщепление прокаспазы 3 и образование активной формы каспазы 3, субъединицы р20 (рис.3А). Кроме того, обработанные SN клетки HT29 и Caco2 были помечены красителем Hoechst 33324 и проанализированы на конденсацию хроматина с помощью флуоресцентной микроскопии (рис.3B). По сравнению с необработанными клетками, ядра клеток SN-CNRZ80 и SN-ITG18 (обработанные пропионатом и ацетатом) сжимались, хроматин конденсировался и, наконец, ядра фрагментировались в апоптотические тела (рис.3B). Таким образом, способ смерти, вызванный пропионибактериями, является апоптозом, а не некрозом.

Рис.3. SCFA, продуцируемый пропионибактериями, индуцирует апоптоз в клетках HT29 и Caco2. (A) SCFA-индуцированная обработка каспазы 3. Клетки обрабатывали SCFA в DMEM. В разное время 5 × 10⁶ клеток подвергали SDS-PAGE, а расщепленную субъединицу p20 каспазы 3 (p17) определяли иммуноблотом. (B) SCFA-индуцированная ядерная конденсация. Клетки культивировали (Co.) или обрабатывали в течение 24 или 48 ч (вставки) в присутствии SN-CNRZ80, SN-ITG18 или пропионата и ацетата натрия с последующим окрашиванием Hoechst 33324 и флуоресцентной микроскопией.

Пропионибактериальный SCFA-индуцированный апоптоз включает митохондриальные изменения, которые противодействуют Bcl-2 и ANT-нацеленному вирусному белку

С целью определения того, включают ли механизмы пропионибактериальной SCFA-индуцированной гибели клеток митохондрии, мы измерили два критических параметра митохондрий, потенциал внутренней мембраны, ΔΨm и генерирование ROS (активных форм кислорода  или рус. АФК), используя комбинацию из двух флуоресцентных зондов, DiOC(6)3 (который является ΔΨm-чувствительным) и HE (Гидроэтидин, который обнаруживает ROS).  Прим. ред.: Гидроэтидин (HE  или Дигидроэтидий) - это широко используемый флуоресцентный зонд на основе этидия, чувствительный к окислительно-восстановительным процессам. Как показано на Фигуре 4А, необработанные клетки (Co.) демонстрировали высокую ΔΨm и низкую флуоресценцию HE. SN из ITG18 и CNRZ80, а также ацетат или пропионат индуцировали уменьшение DiOC(6)3-зависимой флуоресценции и увеличение HE-зависимой флуоресценции, что указывает на увеличение проницаемости митохондриальной внутренней мембраны и усиление генерации АФК (Рис.4А). Кинетика диссипации ΔΨm, вызванной пропионибактериальным SN, ацетатом или пропионатом, была сопоставима (рис.4B). Недавно было продемонстрировано, что vMIA, белок, кодируемый цитомегаловирусом человека, предотвращает апоптоз, предположительно, посредством взаимодействия с клеточными линиями HeLa ANT³³, стабильно трансфицированными только контрольным вектором (Neo), Bcl-2 или vMIA, которые обрабатывали ацетатом. с последующим определением ΔΨm и генерации ROS. Bcl-2 и vMIA обеспечивали значительную защиту от митохондриального воздействия ацетата (рис.4C), пропионата и SN или ITG18 и CNRZ80 (рис.4D). Это указывает на то, что митохондриальные эффекты пропионибактериального SCFA регулируются Bcl-2 и vMIA.

Рис.4. Влияние пропионибактериальных супернатантов и SCFA на параметры митохондрий, связанные с апоптозом. (A) Определение диссипации потенциала внутренней мембраны (ΔΨm) и генерации активных форм кислорода (АФК).Клетки НТ29 культивировали в течение 16 ч с SN-CNRZ80, SN-ITG18, пропионатом или ацетатом с последующим окрашиванием DiOC(6)3 и HE и цитофлуориметрическим анализом. Числа указывают процент клеток, найденных в каждом квадранте. (B) Кинетический анализ диссипации ΔΨm. ΔΨm измеряли в 0, 16, 24 и 36 ч после обработки клеток окрашиванием DiOC(6)3, как при A. (C) Ингибирование апоптоза Bcl-2 и vMIA. Клетки HeLa, трансфицированные только вектором (Neo), геном Bcl-2 человека или геном vMIA, полученным из цитомегаловируса, обрабатывали 15 мМ ацетатом в течение 16 часов с последующим окрашиванием DiOC(6)3 / HE и цитофлуорометрическим анализом, как в А. (D) Сравнение эффектов супернатантов пропионибактерий и чистого SCFA на клетку HeLa, экспрессирующую только ген устойчивости Neo, Bcl-2 или vMIA. Данные являются репрезентативными для двух экспериментов

Пропионибактериальные SCFA действуют на очищенные митохондрии, а также на ANT, восстановленные в протеолипосомы

Когда изолированные митохондрии печени мыши обрабатывали 100 μM Ca²⁺, они подвергались набуханию с большой амплитудой из-за открытия пор комплекса PTP (PTPC), процесса, который можно было ингибировать предварительной обработкой циклоспорином A (CsA), лигандом митохондриального матричного белка циклофилина D, одного из компонентов PTPC (рис.5). Аналогичным образом, SN ITG18 или CNRZ80, а также SCFAs вызывали набухание митохондрий дозозависимым образом (рис.5). Эти эффекты были в значительной степени подавлены CsA, что позволяет предположить, что открытие PTPC, а не неспецифическая дестабилизация мембран жирными кислотами, объясняет проницаемость мембран. Чтобы идентифицировать цель SCFA в PTPC, мы исследовали влияние SN и SCFA на фосфатидилхолин/кардиолипиновые липосомы, содержащие ANT или нет (простые липосомы). Вкратце, ANT был очищен от митохондрий сердца крысы и восстановлен в липосомах, как подробно описано в «материале и методах». Затем, в качестве признака открытия пор ANT (Belzacq et al., 2001) ¹⁶, мы измерили высвобождение флуоресцентного зонда 4-MUP из просвета липосомы. SCFAs, продуцируемые пропионибактериями, лишены какого-либо проникающего эффекта на простые липосомы, но обладают мощным высвобождающим 4-MUP действием на ANT-протеолипосомы (рис.6). Эффекты SCFAs ингибировались двумя природными лигандами ANT, ATP и ADP. В заключение, ANT может быть мишенью или одной из мишеней, вызванной SCFA-проницаемостью митохондриальной мембраны.

Рис.5. Пропионибактериальные SCFAs запускают набухание большой амплитуды в изолированных митохондриях (A) Набухание, вызванное SN ITG18 или CNRZ80. Митохондрии печени мыши были выделены в градиенте Percoll®, а аликвоты (110 мкг белков / мл) были обработаны SN ITG18, CNRZ80 или 100 μM кальция. Поглощение при 540 mm регистрировали в течение 20 мин. 100% набухание представляет собой максимальное набухание, полученное с 100 μM кальция. Необязательно, CsA добавляли за 5 мин до указанных агентов. (B) Набухание митохондрий, вызванное SCFAs. Такую же процедуру, как описано в (А), применяли к различным дозам ацетата, пропионата или смеси обеих кислот в молярном соотношении [2:1]. Значения представляют собой средние проценты ± S.E.M. из трех независимых экспериментов.

Рис.6. Влияние SCFAs на ANT-содержащие липосомы. 4-MUP был инкапсулирован в ANT-липосомы. Затем липосомы ANT инкубировали с 1 mM ADP, 1 mM ATP или только с липосомным буфером (Co.) в течение 30 минут. Атрактилозид или указанную SCFA добавляли в течение еще одного часа при комнатной температуре. Процент высвобождения 4-MUP (указывающий на проницаемость мембраны) определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения представляют собой средние проценты ± S.E.M. из трех независимых экспериментов

Обсуждение

Живые клетки P. freudenreichii ssp.

---

  В этом исследовании мы сообщаем, что различные штаммы и виды пропионибактерий убивают раковые клетки посредством метаболического производства двух SCFAs, пропионата и ацетата.

Это понятие основано на доказательствах того, что (I) SN пропионибактерий были такими же цитотоксичными, как и живые штаммы (рис. 1А); (II) цитотоксический эффект различных штаммов пропионибактерий коррелировал с количеством SCFAs, которые они продуцируют (Рис.1B,C), (III) удаление пропионата и ацетата путем лиофилизации из SN отменило их цитотоксическую активность (Рис.1B,C); и (IV) все субклеточные и молекулярные эффекты, опосредованные SN пропионибактерий, могут быть имитированы только пропионатом и ацетатом или в комбинации (Рисунки 2,3,4,5,6). Было обнаружено, что ED₅₀ пропионата и ацетата относительно высока, около 15 mM. Тем не менее, эти две SCFA не убивают клетки неспецифическим образом, основываясь на обнаружении, что они индуцируют апоптоз, а не некроз (Рис.3), и что их цитотоксические эффекты были антагонизированы избыточной экспрессией двух ингибиторов апоптоза, Bcl-2 и vMIA (рис.4C).

Каков же механизм индукции апоптоза пропионибактериальными SCFAs? Во многих моделях апоптоз можно разделить на три фазы: фазу инициации (пре-митохондриальная фаза), фазу принятия решения (митохондриальная фаза) и фазу деградации (цитоплазматические, ядерные и мембранные изменения. ^19,20 Что касается бутирата^7,34, то апоптоз (вызванный пальмитатом, пропионатом и ацетатом), произошел благодаря стереотипным биохимическим событиям, относящимся к трехфазной модели, включая митохондриальные изменения, активацию каспазы и ядерную деградацию. Точнее, субклеточные события в Caco2 и HT29 клетках, обработанных пропионибактериальным SCFA, имели, по меньшей мере, ΔΨm диссипацию, генерацию ROS, обработку каспазой 3, конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (рис.3, 4). Наши наблюдения показывают, что митохондриальные ингибиторы апоптоза Bcl-2^1,11 и vMIA³³ предотвращают частичное пропионибактериальное SCFA -индуцированное уничтожение клеток указывает на то, что митохондрии играют критическую роль в процессе гибели (рис.4С). Однако для определения того, поддерживают ли митохондрии роль инициатора или нет в апоптозе, вызванном SCFA, могут потребоваться дополнительные эксперименты.

Удивительно, но мы обнаружили, что пропионибактериальные SCFAs индуцировали CsA-ингибируемый отек изолированных митохондрий (Рис.5). Поскольку CsA, по сообщениям, ингибирует PTPC, это свидетельствует о способности SCFAs действовать непосредственно на митохондрии и, точнее, на PTPC. Стимулируемые тем фактом, что vMIA избирательно взаимодействует с ANT ³³, одним из компонентов PTPC, и что vMIA ингибирует апоптоз, вызванный пропионибактериальными SCFAs, (Рис.4C), мы исследовали возможность того, что SCFAs могут непосредственно воздействовать на ANT. Пропионибактериальные SCFAs проникали в ANT-липосомы, но не действовали на липосомы без белка (рис.6). По-видимому, этот эффект включает в себя конформационные или функциональные изменения ANT, потому что он ингибируется АТФ и АДФ (рис.6). Функциональное взаимодействие SCFA-ANT напоминает то, что наблюдается для пальмитата и аналогичных насыщенных длинноцепочечных жирных кислот, которые, как ранее сообщалось, связываются с ANT^35,36 и индуцируют раскрытие PTPC.^37,38 Следует отметить, что эффекты SCFA, полученные на очищенные митохондрии и липосомы ANT наблюдались при гораздо более низких дозах, около 150–300 μM (рис.5, 6), чем дозы, необходимые для уничтожения клеток. Это может быть связано с тем, что плазматическая мембрана не проницаема для анионной формы пропионибактериальной SCFA³⁹ и что анионная форма преобладает при нейтральном pH.

Выяснив проапоптотический способ действия некоторых штаммов пропионибактерий, можно заманчиво рассуждать о медицинском и терапевтическом применении пропионибактериальных SCFAs.

Ранее было показано, что P. acnes, человеческий кожный патоген, косвенно индуцирует апоптоз различных клеток посредством стимуляции синтеза TNFα иммунными клетками⁴⁰. В противоположность этому, мы обнаружили, что три молочных штамма Propionibacterium вызывали апоптоз непосредственно, в HT29, Caco2, или HeLa, без необходимости в дополнительных клетках (рис.1,3,4), по-видимому, через SCFAs. У людей после приема пищевых добавок молочные пропионибактерии выживают при пищеварительном стрессе (опосредованном кислотным рН, солями желчных кислот или гидролазами) в концентрациях, совместимых с потенциальными пробиотическими активностями (концентрация фекалий >10⁶ КОЕ/г)³⁴. В частности, было показано, что штамм P. freudenreichii SI41 переживает транзит через пищеварительный тракт человека⁴¹, что связано с высокоэффективным адаптивным ответом на пищеварительные стрессы.^31,32 Действительно, в недавнем исследовании³² пропионовокислые бактерии (штамм SI41) принимали семь здоровых добровольцев в дозах от 5^.10⁹ (эквивалентно 10 г сыра) до 5^.10¹⁰ (эквивалентно 100 г сыра). В соответствии с оптимальным протоколом пропионибактерии были обнаружены в фекалиях человека в концентрациях от 10⁶ до 10⁷ КОЕ на грамм фекалий, в то время как они не были обнаружены до лечения. Максимальные фекальные концентрации ацетата и пропионата составили 45,7 mM и 11,3 mM, соответственно, после этой обработки против 18,3 и 4,9 mM до обработки. Здесь концентрация ацетата в SN культуры DMEM варьировалась от 9 до 16 mM, а концентрация пропионата - от 26 до 40 mM, в зависимости от используемого штамма пропионибактерий. Параллельно популяция пропионибактерий достигла 15^.10⁶–75^.10⁶ КОЕ/мл (данные не представлены). Таким образом, концентрации пропионибактериальной популяции и SCFA были в одном и том же диапазоне как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Исходя из концентраций SCFA in vitro и in vivo, не исключено, что пропионибактерии могут способствовать индукции апоптоза опухолевых клеток посредством локальной продукции SCFA. Кроме того, in vivo углеводы, которые не были резорбированы в тонком кишечнике, доставляются в толстую кишку, где они ферментируются анаэробной микрофлорой в SCFA.⁶ Таким образом, сообщается о концентрации общего SCFA (ацетат + бутират + пропионат). для достижения значений 100 mM в просвете задней кишки.⁶ Было обнаружено, что бутират, наиболее изученная SCFA, стимулирует пролиферацию нормальных клеток крипты, и в то же время апоптоз клеток колоректального рака.⁶ Кроме того, сообщается, что бутират вызывает колоректальный апоптоз клеток карциномы посредством процесса, который включает остановку клеточного цикла в фазах G0-G1 и G2-M,⁷ ингибирование деацетилазы гистона, активацию DEVD-каспазы, расщепление ингибитора циклин-зависимой киназы p21^Waf1/Cip1,³⁴ Bcl-2 защиту ^42,43 и ДНК-фрагментацию.⁵ Это привело к общему предложению, что SCFAs могут играть роль в профилактике рака пищеварительной системы. Действительно, пища с высоким содержанием клетчатки, которая способствует выработке бутирата, снижает экспрессию Bcl-2, снижает частоту возникновения аберрантных очагов крипт у крыс, а также снижает частоту возникновения колоректального рака у человека, ^44,45,46 Таким образом, наши результаты расширяют гипотезу о том, что SCFAs могут оказывать профилактическое действие на рак толстой кишки⁸ до пропионата и ацетата. Учитывая, что молочные пропионибактерии, как известно, прилипают к подвздошным гликопротеинам человека, ^47,48 к клеткам Caco-2 in vitro (наши неопубликованные данные), а также к кишечной слизи ⁴⁹, они могут служить для локальной доставки SCFAs на уровень колоноцитов. Молочные пропионибактерии, в том числе P. acidipropioninici и P. freudenreichii, в целом признаны безопасными бактериями и уже используются в качестве пробиотиков для человека, главным образом благодаря их бифидогенному действию⁴¹. Будущие клинические и/или эпидемиологические исследования позволят определить, будут ли эти пробиотики также уменьшать pаболеваемость раком толстой кишки.

Раздел «Материалы и методы» см. самостоятельно в источнике

Сокращения:

ANT: адениннуклеотидный транслокатор (осн. белок во внутр. мембране) Atr.: Атрактилозид SN: бактериальный супернатант DMEM Co.: контроль 4-MUP: 4-метилумбеллиферилфосфат 4-MU: 4-метилумбеллиферон ΔΨm: митохондриальный трансмембранный потенциал Csa: циклоспорин А DiOC(6)3: 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide - флуоресцентный краситель (исп. для окрашивания эндоплазматического ретикулума клетки, мембран везикул и митохондрий) HE: hydroethidine (Гидроэтидин) РТРС: комплекс пор с переходной проницаемостью PBR: периферический бензодиазепиновый рецептор RT: комнатная температура ROS: активные формы кислорода (АФК) SCFA: короткоцепочечные жирные кислоты SDS-PAGE: додецилсульфат натрия полиакриламидный гель электрофорез VDAC: зависящий от напряжения анионный канал

Дополнение для профильных специалистов и врачей

Кислотный внеклеточный рН сдвигает гибель клеток колоректального рака от апоптоза к некрозу при воздействии пропионата и ацетата, основных конечных продуктов человеческого пробиотика propionibacteria

Человеческий пробиотик (молочная пропионовокислая бактерия) Propionibacterium freudenreichii убивает клетки колоректальной аденокарциномы путем апоптоза in vitro через свои метаболиты, короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs), ацетат и пропионат. Однако точные механизмы, кинетику клеточных событий и влияние факторов окружающей среды, таких как рН, еще предстоит уточнить. Исследование французских ученых впервые демонстрирует значительное влияние сдвига внеклеточного рН на режим пропионибактериальной SCFA-индуцированной гибели клеток HT-29 в диапазоне водородного показателя рН от 5,5 до 7,5, преобладающем в толстой кишке. Пропионибактериальные SCFAs вызывают апоптоз в диапазоне pH от 6,0 до 7,5, летальный процесс, продолжающийся более 96 часов. Действительно, при pH 7,5 SCFAs индуцируют остановку клеточного цикла в фазе G2/M, за которой следует последовательность клеточных событий, характерных для апоптоза.

Прим. ред.: Переход G2/M является решающим моментом в жизненном цикле клетки. Точка, в которой после успешного завершения второй фазы роста (фаза G2) после репликации своей ДНК (фаза S) начинается митоз (фаза M), фаза, в течение которой она физически разделяется на две дочерние клетки.

Напротив, при pH 5,5 те же самые SCFAs вызывали более быстрый и радикальный летальный процесс менее чем за 24 часа. Это характеризовалось внезапной митохондриальной деполяризацией, проницаемостью внутренней мембраны, резким истощением уровней АТФ и накоплением АФК, что предполагало смерть от некроза. Таким образом, при профилактике рака пищеварительного тракта наблюдаемое изменение pH между апоптозом и некрозом необходимо учитывать в стратегиях, связанных с продуцированием SCFAs пропионибактериями для уничтожения клеток рака толстой кишки.

Источник: Annaïg Lan, Dominique Lagadic-Gossmann, Christophe Lemaire, Catherine Brenner & Gwénaël Jan. Acidic extracellular pH shifts colorectal cancer cell death from apoptosis to necrosis upon exposure to propionate and acetate, major end-products of the human probiotic propionibacteria. Apoptosis volume12, pages573-591(2007)

---

Литература: См. по ссылке "литература к 1 разделу".

Источник: Jan, G.; et al. (2002). "Propionibacteria induce apoptosis of colorectal carcinoma cells via short-chain fatty acids acting on mitochondria". Cell Death and Differentiation. 9 (2): 179–188.

---

Молоко, ферментированное Propionibacterium freudenreichii, индуцирует апоптоз HGT-1 клеток рака желудка человека

Резюме

Рак желудка является одним из самых распространенных видов рака в мире. Образ жизни “экономически развитых стран”, включая рацион питания, является фактором риска, благоприятствующим этому раку. Модуляция диеты может снизить заболеваемость раком желудочно-кишечного тракта. Среди перспективных пищевых компонентов было показано, что молочные пропионибактерии вызывают апоптоз раковых клеток толстой кишки человека через высвобождение ацетата и пропионата короткоцепочечных жирных кислот.

Методология / Основные Выводы:В новом исследовании, ферментированное молоко (исключительно ферментированное молочными пропионовокислыми бяктериями  P. freudenreichii) продемонстрировало проапоптотический потенциал на клетках рака желудка человека HGT-1.

Ферментированный надосадочный продукт молока (супернатант) индуцировал типичные признаки апоптоза, включая конденсацию хроматина, образование апоптотических телец, захват ДНК, остановку клеточного цикла и появление популяции subG1, воздействие фосфатидилсерина на внешнюю листовую пластинку плазматической мембраны, накопление активных форм кислорода, нарушение митохондриального трансмембранного потенциала, активацию каспазы и высвобождение цитохрома С. Примечательно, что это новое кисломолочное содержание P. freudenreichii усиливает цитотоксичность камптотецина, препарата, применяемого при химиотерапии рака желудка.

Выводы / Значимость: Таким образом, такое новое пробиотическое ферментированное молоко может быть полезно в составе профилактической диеты, предназначенной для профилактики рака желудка и/или в качестве пищевой добавки для потенцирования терапевтического лечения рака.

Введение

Диета модулирует риск развития рака желудка

Рак является основной причиной смерти в экономически развитых странах в результате выбора образа жизни, связанного с раком, включая курение, отсутствие физической активности и “вестернизированную” диету [1]. Действительно, роль диеты в развитии рака подтверждается эпидемиологическими исследованиями, в частности в отношении рака желудочно-кишечного тракта. Рак желудка (Gastric cancer (GC)) представляет собой третий тип смертельного рака для мужчин в мире. В 2008 году было оценено 640.600 случаев GC, что привело к 464.400 смертей во всем мире [1]. Это заболевание особенно часто встречается в Восточной Азии, а также в Центральной и Восточной Европе. Наиболее важными этиологическими факторами, участвующими в канцерогенезе желудка, являются диета и инфекция Helicobacter pylori. Существенные данные, главным образом из исследований по контролю случаев заболевания, свидетельствуют о том, что риск заражения GC повышается при высоком потреблении соленых, маринованных или копченых традиционных продуктов питания, а также сушеной рыбы и мяса. Напротив, было обнаружено, что пищевые волокна, свежие овощи и фрукты, возможно, из-за их содержания витамина С, обратно связаны с риском GC [2,3]. Таким образом, влияние природных/пищевых компонентов на канцерогенез желудка было исследовано в течение последних нескольких десятилетий [4–6]. Среди них пробиотики и их способность ингибировать развитие рака вызвали научный интерес [7,8]. Пробиотик обычно определяется как ”живой микроорганизм, который при введении в достаточном количестве приносит пользу для здоровья хозяина" [9]. В то время как некоторые микроорганизмы, такие как H. pylori, могут благоприятствовать GC, другие могут оказывать благотворное влияние, предотвращая рак пищеварительной системы. В частности, выделенные штаммы пробиотических бактерий могут ограничивать развитие рака в животных моделях канцерогенеза [10]. Это особенно проявилось при раке толстой кишки, тогда как о возможном воздействии пробиотиков на GC известно мало. Возможным механистическим объяснением такого защитного эффекта является высвобождение in situ антиканцерогенных метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs).

Короткоцепочечные жирные кислоты P. freudenreichii индуцируют апоптоз раковых клеток

Уксусная кислота (ацетат)	Попионовая кислота (пропионат)

SCFAs, включая ацетат, пропионат и бутират, важные анионы кишечного содержания и их концентрация могут быть модулированы диетой. Было показано, что они играют ключевую роль в важных физиологических функциях, включая модуляцию баланса пролиферации/апоптоза пищеварительных эпителиальных клеток. Это включает в себя SCFA-опосредованную задержку клеточного цикла, ингибирование гистоновой деацетилазы и стимуляцию апоптоза в трансформированных клетках, а также стимуляцию дифференцировки в здоровых клетках [11,12]. Также сообщалось, что пропионат и бутират SCFAs индуцируют апоптоз в клеточных линиях карциномы желудка человека [13–15]. Апоптоз - это естественный физиологический процесс, позволяющий регулировать количество клеток и являющийся мишенью для противоопухолевой химиотерапии [16]. Апоптоз позволяет истощать раковые клетки в “чистом" виде. Раковые клетки фрагментируются в скоординированной цепной реакции, а остатки поглощаются соседними тканями и иммунной системой [17,18]. Описаны два основных апоптотических пути: внешний, опосредованный активацией рецепторов смерти и каспазы 8, и внутренний, в котором участвуют митохондрии и каспаза 9 [16]. Как правило, в раковых клетках отсутствует апоптотическая функция, что может объяснить их устойчивую пролиферацию и, следовательно, образование опухолей. Таким образом, способность индуцировать апоптоз раковых клеток признается за ее терапевтический потенциал [16]. Поскольку молочные пропионибактерии способны продуцировать полезные проапоптотические SCFAs, они могут оказаться полезными в профилактике или лечении рака.

P. freudenreichii может способствовать апоптотическому истощению раковых клеток пищеварительного тракта.

Было показано, что этот пробиотические молочные пропионибактерие индуцируют клеточную гибель различных линий клеток рака толстой кишки человека посредством индукции апоптоза в совместных культурах [19]. Активные соединения, секретируемые в среду, запускают собственный митохондриальный апоптотический путь в культивируемых клетках колоректального рака человека. В частности, ацетат и пропионат SCFAs, высвобождаемые P. freudenreichii, индуцируют апоптоз, воздействуя на транслокатор аденин-нуклеотидов митохондрий, вызывая деполяризацию и пермеабилизацию митохондрий, утечку цитохрома С и активацию каспазы [19,20]. Однако пропионибактериальные супернатанты все еще более проапоптотичны, чем ацетат и пропионат SCFA, используемые при концентрациях, измеренных в супернатантах, что позволяет предположить, что в этот эффект могут быть вовлечены другие соединения. Отдельные штаммы P. freudenreichii остаются живыми и метаболически активными в кишечнике человека и крыс, ассоциированных с микробиотой человека, где они продуцируют SCFA [21,22]. Соответственно, было показано, что они усиливают апоптоз в трансформированных эпителиальных клетках толстой кишки таких крыс, получавших канцероген 1,2-диметилгидразин (DMH), но не у контрольных здоровых [23]. Пропионибактерии могут представлять собой пробиотики, способствующие профилактике рака толстой кишки, при условии, что они достигают своей цели живыми и метаболически активными. В этом контексте было показано, что вектор или пробиотический носитель доставки определяет выживаемость и активность пропионибактерий [21, 24,25]. В частности, сложные молочные продукты, такие как йогурт и сыр, защищают пропионибактерии от стресса, но содержат сложную смесь бактерий. Таким образом, невозможно приписать полезный эффект конкретному штамму.

В этом контексте в качестве средства доставки пропионибактерий оценивали сквашенное молоко.

В этом исследовании мы использовали новое пищевое кисломолочное молоко, содержащее только P. freudenreichii в качестве единственной микрофлоры. Поскольку этот продукт содержит как живые пропионибактерии, так и их активные метаболиты, он должен привести их в контакт со слизистой оболочкой желудка при приеме внутрь.Это ферментированное молоко исследовали в отношении индукции апоптоза клеток рака желудка человека HGT-1. Действительно, пропионибактерии, как известно, убивают клетки рака толстой кишки человека, но их влияние на клетки рака желудка неизвестно. Ферментированное молоко убивало клетки HGT-1 в зависимости от времени и дозы. Наблюдались типичные особенности процесса апоптоза, в том числе снижение жизнеспособности, конденсация хроматина, образование апоптотических тел, расщепление ДНК, продуцирование АФК, нарушение потенциала митохондриальной мембраны, активация каспазы, остановка клеточного цикла и появление популяции subG1.

Результаты

P. freudenreichii-ферментированное молоко убивает клетки рака желудка и толстой кишки человека

P. freudenreichii ITG P9 вырос через 72 ч при 30°C в добавленном молоке и ультрафильтрате добавленного молока, достигнув конечной популяции 9,43 log₁₀ колониеобразующих единиц КОЕ/мл и 9,35 log₁₀ КОЕ/мл, соответственно. Концентрации SCFAs составляли 26,21 mM  ацетата и 54,47 mM  пропионата (соотношение 2,08 пропионат/ацетат) в супернатанте ферментированного молока, тогда как в супернатанте ультрафильтрата ферментированного молока они составляли 24,00 mM и 53,32 mM  (соотношение 2,22 пропионат/ацетат). Эти соотношения ожидались для пропионибактерий, которые обычно производят в два раза больше пропионата, чем ацетата [26]. Были также протестированы двенадцать других пищевых молочных штаммов пропионибактерий (см. таблицу S1 и рисунок S1). Используя эти штаммы, было получено двенадцать ферментированных кисломолочных продуктов. Концентрации пропионата варьировались от 36 до 67 mM и популяции пропионибактерий от 9,0 до 9,7 log₁₀ КОЕ/мл, для менее и для наиболее эффективного штамма соответственно.

Исследовали цитотоксический потенциал супернатантов, полученных из молока или ультрафильтрата молока, ферментированных P. freudenreichii ITG P9. Клетки рака толстой кишки человека HT-29 и клетки рака желудка человека HGT-1 обрабатывали этими супернатантами. Были испытаны различные разбавления в пределах от 1/2 до 1/16. Кроме того, была исследована цитотоксичность смеси 15 mM ацетата и 30 mM пропионата в концентрациях, близких к этим 1/2 разбавленным супернатантам. В качестве положительного контроля индукции апоптоза для клеток HGT-1 и HT-29 использовали химиопрепараты камптотецин (4 µM) и этопозид (100 µM) соответственно. Было проведено сравнение трех различных методов мониторинга гибели клеток. Как показано на рисунке S2, анализы исключения метиленового синего, МТТ и трипанового синего дают сходную кинетику смерти. Следовательно, метиленовый синий анализ был использован в этом исследовании для дальнейшей оценки жизнеспособности клеток. Неферментированные молочные продукты (молоко или молочный ультрафильтрат) не имели никакого эффекта, ни на НТ-29, ни на HGT-1 жизнеспособность клеток (рис.1А,Б). Супернатант молока или ультрафильтрат молока, ферментированный P. freudenreichii, индуцировал аналогичную цитотоксичность во времени в клетках HT-29 и HGT-1 и близок к цитотоксичности, индуцированной лекарственными средствами или смесью ацетата/пропионата. Половинное максимальное уничтожение клеток HGT-1 происходило через 24 ч и 26 ч обработки супернатантами ферментированного молока и ультрафильтрата ферментированного молока соответственно, через 17 ч обработки камптотецином и через 24 ч обработки смесью SCFA (Рис.S3). Кроме того, цитотоксичность супернатантов ферментированных молочных продуктов в клетках HGT-1 была дозозависимой (рис.1С). Для каждого испытанного разведения падение жизнеспособности клеток HGT-1, индуцированное ферментированным молоком или ультрафильтратом ферментированного молока, было очень похоже (Рис.1Сирис.S3). Именно поэтому следующие этапы исследования мы проводили только с супернатантом ультрафильтрата кисломолочного продукта. Взятые вместе, эти данные указывают на то, что пропионибактерии эффективно убивают клетки рака толстой кишки и желудка человека, по крайней мере частично за счет производства пропионата и ацетата (Рис.1). Некоторые другие ферментированные молочные продукты, ферментированные различными штаммами молочных пропионибактерий, показали аналогичные цитотоксические эффекты на раковые клетки (таблица S2). P. freudenreichii ITG P9 будучи известным своей метаболической активностью in vivo [22], способствовал тому, что соответствующее ферментированное молоко было дополнительно изучено.

Рисунок 1. P. freudenreichii-ферментированное молоко убивает человеческие колоректальные и желудочные раковые клетки.

(A) влияние ферментированного молока P. freudenreichii на клетки колоректального рака человека HT-29. Клетки HT-29 обрабатывали 1/2 разведением в DMEMc супернатантов, полученных из ферментированного молока или ультрафильтрата ферментированного молока (квадраты). В качестве отрицательного контроля клетки обрабатывали 1/2 разведениями неферментированного молока или ультрафильтрата молока (алмазы). В качестве положительного контроля (треугольники) клетки обрабатывали DMEMc, содержащим смесь ацетата и пропионата (C2/C3, 15/30 mM) или этопозида (100 µM). (B) влияние ферментированного молока P. freudenreichii на HGT-1 раковые клетки желудка человека. Клетки HGT1 обрабатывали 1/2 разведением в DMEMc супернатантов, полученных из ферментированного молока или ультрафильтрата ферментированного молока (квадраты). В качестве отрицательного контроля клетки обрабатывали 1/2 разведениями неферментированного молока или ультрафильтрата молока (алмазы). В качестве положительного контроля (треугольники) клетки обрабатывали DMEMc, содержащим смесь ацетата и пропионата (C2/C3, 15/30 mM) или камптотецина (4 µM). (C) Дозозависимость цитотоксического действия ферментированного молока. Клетки HGT-1 обрабатывали различными разведениями супернатанта, полученного из молока (пустые символы) или ультрафильтрата молока (простые символы), ферментированного P. freudenreichii. Жизнеспособность клеток определяли методом метиленового синего после различных периодов лечения. Процент жизнеспособности рассчитывали по следующей формуле: 100×(значения оптической плотности обработанных клеток/значения оптической плотности необработанных клеток). Результаты представляют собой средние значения трех экспериментов.

Ферментированное P. freudenreichii молоко индуцирует типичные признаки апоптоза в клетках рака желудка человека

Морфологию ядер клеток HGT-1, инкубированных в присутствии ультрафильтрата ферментированного P. freudenreichii молока, анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии после окрашивания Hoechst 33342 (рис. 2А). Ядерная флуоресценция необработанных клеток (контроль) оставалась неизменной в течение времени эксперимента с синими нормальными ядрами (время 0 ч,  рис. 2Aa). Во время обработки клетки HGT-1 демонстрировали конденсированный хроматин и фрагментированные ядерные характеристики апоптотических ядер (рис. 2Ab,c), с последующим появлением апоптотических тел через 72 ч (рис. 2Ad). Во время обработки ультрафильтрата ферментированного молока также наблюдали фрагментацию межнуклеосомной ДНК, приводящую к разбиению ДНК, что является типичным признаком апоптоза [27]. Фрагментация ДНК наблюдалась с 24 ч обработки ультрафильтратом ферментированного молока (рис. 2B), и в меньшей степени с камптотецином (рис. S3). Содержание ДНК также количественно определяли методом проточной цитометрии после мечения иодидом пропидия для изучения влияния ультрафильтрата ферментированного молока на распределение клеточного цикла HGT-1 (рис. 2С). Необработанные клетки HGT-1 представили распределение клеточного цикла (рис. 2Ca) без фазы subG1, которая оставалась неизменной в течение всего времени проведения эксперимента (данные не показаны). Процент клеток в фазе subG1, свидетельствующий об апоптотическом процессе, значительно увеличивался со временем при обработке ультрафильтратом ферментированного молока (рис. 2Сb, Cc, Cd): через 24 ч (39,24±4,87%), через 48 ч (91,63±0,28%) и через 72 ч (94,79±0,45%). При 48 ч и 72 ч лечения все клетки находились в фазе клеточного цикла subG1, что указывает на полную гибель клеток HGT-1. В качестве контроля камптотецин индуцировал сходные апоптотические признаки в клетках HGT-1 (рис. S4).

Рисунок 2. Ультрафильтрат ферментированного P. freudenreichii молока индуцирует типичные ядерные метки апоптоза в раковых клетках желудка человека.

(А) Ядерная конденсация, вызванная ультрафильтрацией ферментированного молока. Клетки культивировали (0 ч) или обрабатывали в течение 24, 48 или 72 ч 1/2 разведением супернатанта ультрафильтрата (UF) из ферментированного молока P. freudenreichii. Затем клетки окрашивали Hoechst 33342 перед флуоресцентной микроскопией. Стрелки указывают на конденсацию хроматина (b), фрагментацию ядра (c) и образование апоптотических тел (d). (B) Фрагментация ДНК ферментированного молока, вызванная ультрафильтратом, в клетках HGT-1 Геномную ДНК экстрагировали и анализировали в 1% агарозном геле. Клетки HGT-1 обрабатывали, как в (А). (C) Изменения в распределении фаз клеточного цикла, вызванные ультрафильтрацией ферментированного молока. Содержание ДНК в клетках HGT-1 анализировали проточной цитометрией после окрашивания йодидом пропидия. Представлены гистограммы, соответствующие анализу содержания ДНК клеток HGT-1. Указан процент клеточной популяции с содержанием ДНК sub-G1, указывающий на апоптоз. Пропорция каждого подмножества клеток (sub-G1, G0 / G1, S, G2 / M) в общей клеточной популяции показана для каждого времени лечения. Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов ± SD. * P <0,05, ** P <0,01, обработанные клетки по сравнению с контролем (0 ч). Распределение фаз клеточного цикла необработанных клеток (контроль) оставалось неизменным в течение всего эксперимента.

Рисунок 3. Ультрафильтрат ферментированного P. freudenreichii молока индуцирует воздействие фосфатидилсерина на наружную створку плазматической мембраны в раковых клетках желудка человека.

Проточная цитометрия, кинетический анализ гибели клеток в клетках HGT-1, обработанных ультрафильтратом ферментированного молока P. freudenreichii. (A) Показан репрезентативный эксперимент по окрашиванию аннексином V / 7-AAD клеток HGT-1 в каждый момент лечения с пропорциями аннексин V-положительных клеток (AV +; апоптотические клетки). (B) Количественный FACS-анализ связывания аннексина V-FITC (AV) с клетками HGT-1 выполняли после окрашивания 7-аминоактиномицином-D (7AAD). Представленные значения соответствуют доле каждого подмножества клеток в общей популяции клеток для каждого времени лечения. Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов ± SD. * P <0,05, ** P <0,01, обработанные клетки по сравнению с контролем (0 ч).

Поскольку SCFAs воздействуют непосредственно на митохондрии, также были определены три важных митохондриальных параметра: потенциал внутренней мембраны ΔΨm и генерация АФК с использованием двух флуоресцентных зондов, DiOC(6)3 (который чувствителен к ΔΨm) и DHE (который обнаруживает уровень O₂^-) и локализация цитохрома С. Необработанные клетки (0 ч) демонстрировали высокую флуоресценцию (высокое ΔΨm) и низкую флуоресценцию DHE (низкое продуцирование O2^-) (рис. 4A, B). После обработки ультрафильтратом ферментированного молока наблюдалось зависящее от времени уменьшение включения флуоресцентного зонда DiOC6(3), что выявило потерю ΔΨm и, следовательно, деполяризацию митохондриальной мембраны (рис. 4А). Процент обработанных клеток HGT-1 с уменьшенным потенциалом внутренней мембраны увеличивался в зависимости от времени и достигал 96% клеток через 72 часа. Лечение FCCP использовали в качестве положительного контроля деполяризации митохондриальной мембраны. Эта потеря ΔΨm была подтверждена характеристической потерей красной флуоресценции после окрашивания JC-1 (рис. 4B). Что касается продукции АФК в клетках HGT-1, обработка ультрафильтратом ферментированного молока вызывала накопление O2-, значительно через 48 ч и 72 ч обработки (рис. 4C). Это накопление АФК может быть частично предотвращено, если клетки предварительно обрабатывают поглотителем АФК TEMPOL (рис. S6). Высвобождение цитохрома С из митохондрий в цитоплазму является ключевым клеточным событием программы апоптоза. Иммуноблоттинговое исследование обогащенных цитоплазмой фракций на наличие цитохрома С подтвердило изменение его субклеточной локализации (рис. 4D). Цитохром C был обнаружен во фракции, обогащенной цитоплазмой, через 24 часа после обработки, что указывает на перемещение этого белка (рис. 4D). Это перемещение локализации цитохрома C в цитоплазме было подтверждено иммуноокрашиванием, демонстрирующим диффузное иммуноокрашивание по всей клетке после обработки, в то время как окрашивание акцентировалось до обработки (рис. 4E).

Рисунок 4. Ультрафильтрат ферментированного P. freudenreichii молока индуцирует митохондриальные метки апоптоза в раковых клетках желудка человека.

Кинетический анализ митохондриальных событий в клетках HGT-1, обработанных ультрафильтратом ферментированного P. freudenreichii молока (A). Проточная цитометрия, кинетический анализ диссипации митохондриальной внутренней мембраны (ΔΨm) с окрашиванием DiOC(6)3. Показан вид наложения репрезентативного эксперимента. В качестве положительного контроля использовали развязку FCCP (50 µM, 20 мин). Приведены количественные анализы потерь ΔΨm в 3 независимых экспериментах. Значения представлены в виде доли клеток с низким ΔΨm в общей клеточной популяции для каждой обработки. Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов ± SD. * P <0,05, ** P <0,01, лечение в сравнении с контролем (0 ч). (B) Клетки HGT-1 окрашивали JC-1. О потере митохондриального мембранного потенциала свидетельствует прогрессирующая потеря флуоресценции агрегата красного JC-1 и цитоплазматическая диффузия флуоресценции зеленого мономера (C). Кинетический анализ проточной цитометрии накопления анион супероксида (O₂^-) с окрашиванием DHE. Показано наложение репрезентативного эксперимента по обнаружению АФК в каждый момент лечения. Клетки окрашивали дигидроэтидием и анализировали проточной цитометрией. В качестве положительного контроля использовали прооксидант менадион (Men., 100 µM, 15 мин). Значения представлены как доля клеток с повышенным АФК (увеличение интенсивности флуоресценции) в общей клеточной популяции для каждой обработки. Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов ± SD. * P <0,05, ** P <0,01, лечение в сравнении с контролем (0 ч). (D) Перемещение цитохрома С в течение всего периода лечения супернатантом ультрафильтрата ферментированного P. freudenreichii молока 1/2 оценивали методом вестерн-блоттинга.

Прим. ред.: Вестерн-блоттинг (иммуноэлектроблоттинг, белковый блоттинг) – это метод идентификации уникальных белков. В его основе лежит явление высокоспецифичного взаимодействия антиген–антитело. Таким образом, антигеном (мишенью) является определяемый белок, а зондом – антитело к нему.

После обработки клеток фракции, обогащенные цитоплазмой, анализировали методом вестерн-блоттинга и выявляли с помощью антитела против цитохрома С. В качестве контроля нагрузки использовали антитела, направленные против Hsc-70. (E) Субклеточная локализация цитохрома С. Клетки иммуноокрашивали антителом против цитохрома С после окрашивания MitoTracker и до окрашивания ДНК с использованием TO-PRO 3. Стрелка указывает на диффузию цитохрома С в цитоплазме.

P. freudenreichii ферментированное молоко активирует каспазы

Для подтверждения апоптотических механизмов, индуцированных ультрафильтратом ферментированного молока в клетках HGT-1, анализировали обработку каспаз 3, 8 и 9 методом вестерн-блоттинга и соответствующим мониторингом ферментативной активности в клеточных экстрактах HGT-1 (рис. 5). Ультрафильтрат неферментированного молока не индуцировал активацию каспазы в клетках HGT-1: на вестерн-блоте были обнаружены только проформы каспазы-3 и -9 (рис. 5А), а активность каспазы не измерялась (рис. 5B). Супернатант ультрафильтрата ферментированного молока, а также камптотецин или смесь пропионата и ацетата в молярном соотношении [2:1] вызывали расщепление прокаспазы 3 и образование активных форм каспазы-3, субъединиц р17 и р12 (рис. 5А). Активация каспазы-3, которая является эффекторной каспазой, подтвердила индукцию апоптоза. Кроме того, ферментированный ультрафильтрат молока индуцировал расщепление прокаспазы-9, приводя к обработанным формам 35 и 37 кДа. Каспаза-8 не была обнаружена в контрольных необработанных клетках HGT-1. Однако обработка пропионибактериальными супернатантами или смесью C2/C3 приводила к четкому обнаружению проформы 54 КДА с последующим ее расщеплением через 48 ч обработки.

Рисунок 5. Ультрафильтрат ферментированного P. freudenreichii молока активирует каспазы в клетках рака желудка человека

Обработка эффекторной каспазы 3 и инициаторных каспаз 8 и 9 сопровождалась вестерн-блоттингом и мониторингом специфической ферментативной активности в клетках HGT-1. (A) Проформы и расщепленные субъединицы каспазы 3, 8 и 9 были обнаружены вестерн-блоттингом в лизатах клеток HGT-1, обработанных супернатантом ультрафильтрата ферментированного молока P. freudenreichii 1/2. Ультрафильтрат неферментированного молока (UF !/2, 48 ч), смесь ацетата и пропионата (C2 / C3, 15/30 mM, 48 ч) и камптотецина (4 µM, 48 ч) использовали в качестве контролей. Антитела, направленные против Hsc-70, использовали в качестве контроля нагрузки. (B) Специфическую активность каспаз лизатов из клеток, обработанных, как указано выше, изучали с использованием указанных пептидов и рассчитывали, как описано в материалах и способах. Результаты представляют собой средние значения трех экспериментов ± SD. * P <0,05, ** P <0,01, лечение в сравнении с контролем (0 ч).

Количественное определение ферментативной активности каспазы-3, -8 и -9 подтвердило активацию каспазы как метаболитами пропионибактерий, так и камптотецином. Действительно, каспазы-9 и -3 были активированы на самых ранних этапах лечения, тогда как каспаза-8, по-видимому, активировалась позже (рис. 5B). Камптотецин и смесь SCFAs активировали все три изученных каспазы. Эти данные подтвердили активацию внутреннего пути апоптоза обработкой ультрафильтратом ферментированного молока с ранней активацией каспазы-9, а затем каспазы-3 и -8.

Ферментированное P. freudenreichii молоко повышает цитотоксичность камптотецина

Камптотецин является цитотоксическим алкалоидом хинолина, который ингибирует фермент ДНК топоизомеразу I (тоpо I) и широко используется при химиотерапевтическом лечении GC. Выше мы показали, что метаболиты пропионибактерий вызывают апоптоз в клетках HGT-1 через путь гибели митохондрий. Затем мы изучили апоптоз, вызванный сочетанием как камптотецина, так и ультрафильтрата ферментированного молока в клетках HGT-1. Повышенные концентрации камптотецина (0, 0,25, 0,5, 1, 2 µM) в сочетании с повышенными концентрациями ультрафильтрата ферментированного молока (0, 1/16, 1/8, 1/4) были протестированы на жизнеспособность клеток HGT-1 и вызвали потерю жизнеспособности HGT-1, в зависимости от дозы (рис. 6). Кроме того, добавление ультрафильтрата ферментированного молока значительно усиливало цитотоксичность камптотецина в клетках HGT-1 (рис. 6). Например, 0,25 µM камптотецина и ультрафильтрата ферментированного молока, разбавленного до 1/8, приводили к потере жизнеспособности на 8,6% и 18,6% соответственно. Комбинация этих двух соединений привела к потере жизнеспособности клеток на 29,8% (рис. 6), что свидетельствует о дополнительном цитотоксическом эффекте, когда камптотецин был объединен с ультрафильтратом ферментированного молока в клетках HGT-1. Соответственно, индекс комбинации (CI), рассчитанный как ранее [28], имеет значение 1, что указывает на аддитивный эффект обработки камптотецином и ультрафильтратом кисломолочного молока.

Рис. 6. Ферментированное P. freudenreichii молоко усиливает цитотоксичность камптотецина в раковых клетках желудка человека.

Жизнеспособность HGT-1 рака желудка человека, пролеченного в течение 24 часов, оценивали с помощью анализа с метиленовым синим. Клетки HGT-1 обрабатывали различными концентрациями камптотецина (от 0 до 2 µM) вместе с различными разведениями супернатанта ультрафильтрата ферментированного молока (UF) P. freudenreichii. Процент жизнеспособности рассчитывали по следующей формуле: 100 × (значения оптической плотности обработанных клеток / значения оптической плотности необработанных клеток). Результаты представляют собой средние значения трех экспериментов ± SD. * P <0,05, ** P <0,01, обработанные клетки в сравнении с контролем (та же концентрация камптотецина без супернатанта ультрафильтрата ферментированного молока и такое же разбавление ультрафильтрата ферментированного молока без камптотецина).

Обсуждение

Был разработан новый кисломолочный напиток, содержащий P. freudenreichii в качестве единственной бактерии, для дальнейшего изучения пробиотического потенциала этого молочного препарата пропионовокислых бактеорий (см. Обзор [29]). В этом исследовании мы сообщаем, что водная фаза этого ферментированного молока убивает клетки толстой кишки и рака желудка человека через метаболиты, в том числе пропионат и ацетат, выделяемые этой бактерией. Это представление основано на наблюдаемых цитотоксических эффектах супернатантов ферментированного P. freudenreichii молока на культивируемых раковых клетках HT-29 и HGT-1. Этот эффект был получен с помощью ультрацентрифугирующих супернатантов, то есть водной фазы ферментированного молока, лишенной казеинов и бактерий, что показывает, что активные соединения секретируются, как описано ранее для пропионибактерий [19]. По этой причине большинство экспериментов в этой работе было выполнено с ультрафильтратом ферментированного молока (рис. 1). Мы впервые продемонстрировали, что супернатант ферментированного молока P. freudenreichii индуцирует апоптоз клеток HGT-1 в зависимости от времени и дозы с появлением классических морфологических и биохимических особенностей апоптоза (конденсированная и фрагментированная хроматизация, «лестничная» структура ДНК и накопление клеток в фазе клеточного цикла subG1).

Затем мы выяснили, были ли клеточные механизмы, участвующие в пути гибели клеток HGT-1, сходными с митохондриальным путем смерти, запускаемым в клетках рака толстой кишки человека Caco-2 и HT-29 супернатантами культуры DMEMc P. freudenreichii [19,20]. Субклеточные и биохимические события, наблюдаемые в обработанных клетках HGT-1 с ультрафильтратом ферментированного молока, были сходными и включали, по меньшей мере, потерю митохондриального ΔΨm, образование ROS (O₂^-), процессинг и активацию каспаз, перемещение цитохрома С в цитоплазму (рис. 3, 4, 5). Супернатант ферментированного молока индуцировал процессинг и активацию каспазы-8, в дополнение к каспазам -3 и -9. Кроме того, на фигуре 4А показано, что каспаза-8 не обнаружена в контрольных необработанных клетках и в клетках, обработанных ультрафильтратом камптотецина или неферментированного молока, в соответствии с отсутствием его мРНК (C. Le Jossic-Corcos, Медицинский факультет, Брест Франция, личное общение). Следует отметить, что существует явное расхождение между ферментативными результатами, что свидетельствует об активности каспазы-8 в клетках, обработанных камптотецином, в то время как каспаза-8 в этих клетках не обнаруживается вестерн-блоттингом. Это может быть объяснено отсутствием специфичности субстрата Ac-IETD-AMC, который может обрабатываться другими ферментами, такими как каспазы -3 и -10, или гранзимом B, особенно если концентрация таких ферментов повышена [30,31].

Прим. ред.: Ac-IETD-AMC представляет собой флуорогенный субстрат каспазы-8 / гранзима B, содержащий ацетил (Ac) фрагмент. Этот субстрат гидролизуется каспазой 8 с образованием высокофлуоресцентного 7-амидо-4-метилкумарина (АМС).

Напротив, ультрафильтрат ферментированного Propionibacterium freudenreichii молока и смесь SCFA вызывали экспрессию и активацию каспазы-8. Механизмы, вовлеченные здесь, не выяснены; однако известно, что каспаза-8 недостаточно экспрессируется в некоторых раковых клетках в результате метилирования ДНК [32,33]. Его экспрессия может быть восстановлена на уровне РНК и белка деметилирующими агентами, такими как децитабин [34] и ингибиторы HDAC [35], что приводит к деметилированию регуляторной последовательности каспазы-8, увеличению активности промотора каспазы-8 и ре -экспрессии каспазы-8 [32]. SCFAs, такие как пропионат, являются ингибиторами HDAC, что приводит к гиперацетилированию гистонов [36]. Это способствует транскрипции через изменение конформации ДНК [37] и может восстановить экспрессию каспазы-8. Это способствует транскрипции через изменение конформации ДНК [37] и может восстановить экспрессию каспазы-8. Было показано, что другие пищевые соединения восстанавливают экспрессию каспазы-8. Инъецируемый экстракт из Semen coicis (родственника кукурузы), проявляющий противоопухолевую активность, усиливает экспрессию каспазы 8 и индуцирует апоптоз в клетках HepG2 [38]. Диаллилдисульфид, обнаруженный в чесноке, усиливает экспрессию каспазы-8, Fas и FasL в клетках K562 лейкемии. Таким образом, такая регуляция может быть связана с проапоптотическим действием молочных пропионибактерий и содержащих их ферментированных продуктов. Вестерн-блоттинг свидетельствовал о восстановлении экспрессии и последующей поздней активации каспазы-8 в клетках HGT-1, обработанных пропионибактериальными метаболитами, что может происходить в результате активации каспазы-8 другой каспазой, такой как каспаза-9. Действительно, было показано, что выход цитохрома С, являющегося частью митохондриального пути, активирует несколько каспаз, в том числе 2, 3, 6, 7, 8 и 10 [39]. Кроме того, было показано, что активация каспазы-9 приводит в последующем к активации каспазы-8 [40]. Соответственно, было показано, что каспаза-9 in vitro активирует каспазу-3, которая, в свою очередь, активирует каспазу-6, ответственную за активацию каспазы-8 [41]. В целом наши результаты подтверждают, что метаболиты пропионибактерий, присутствующие в ферментированном P. freudenreichii молоке, вызывают несколько субклеточных механизмов, способствующих апоптозу. Такая реактивация экспрессии каспазы-8 может привести к основному апоптотическому ответу в клетках HGT-1, обработанных агонистами рецепторов мертвого домена (например, Trail или Fas).

Насколько нам известно, это первая работа, в которой сообщается о специфической индукции апоптоза раковых клеток желудка ферментированным молочным продуктом.

Предполагается, что кисломолочные продукты, в том числе йогурт, полезны для профилактики рака толстой кишки. Эпидемиологические данные о защитном воздействии молока и молочных продуктов на уровень рака толстой кишки дали противоречивые результаты [42]. Молоко и общее потребление молочных продуктов связано с уменьшением риска развития колоректального рака. Но это не относится ко всем видам молочных продуктов, и эффекты сильно различаются. Ферментированные молочные продукты могут представлять собой эффективные средства доставки для нацеливания защитных молекул или микроорганизмов на определенные участки, такие как пищеварительный эпителий [43]. Бычий лактоферрин, компонент молока, вызывает апоптоз раковых клеток толстой кишки [44] и желудка [45]. Отдельные штаммы микроорганизмов, присутствующие в кисломолочных продуктах, также могут противодействовать канцерогенезу толстой кишки. Соответственно, йогурт и молочнокислые бактерии проявляли противораковые свойства на животных моделях канцерогенеза толстой кишки [46]. Однако немного работ было сосредоточено на сброженных молочных продуктах и ​​раке желудка.

Наша работа предполагает, что P. freudenreichii может играть роль и в этом контексте, так как он доставляет как живые пропионибактерии, так и проапоптотические метаболиты в слизистую оболочку желудка. 

В этом контексте следует отметить, что Propionibacterium freudenreichii прилипает к клеткам пищеварительного эпителия и к слизи [47,48]. Было также показано, что он ингибирует адгезию возбудителя рака желудка Helicobacter pylori к пищеварительным эпителиальным клеткам, а также повреждения, вызванные Helicobacter pylori [49]. Эти свойства указывают на важную роль молочных P. freudenreichii в профилактике рака желудка.

---

Наконец, наше сквашенное молоко усилило проапоптотическое действие препарата камптотецина на клетки рака желудка. Соответственно, ранее было показано, что живые культуры пробиотических лактобацилл сенсибилизируют клетки колоректального рака LS513 к 5-фторурацилу [50]. Однако в этом случае одни пробиотики не оказывали проапоптотического эффекта. В этой работе низкие дозы препарата камптотецина, используемого при химиотерапии рака желудка, были неэффективны в уничтожении клеток рака желудка. Однако в присутствии низких доз ферментированного молока P. freudenreichii они эффективно убивали одни и те же клетки (рис. 6). Метаболиты пропионибактерий индуцируют собственный путь апоптоза, воздействуя непосредственно на митохондрии, в то время как камптотецин действует на уровне ДНК. Это согласуется с их кумулятивным потенциалом в индукции апоптоза, когда эти проапоптотические индукторы объединены. Кроме того, ферментированное молоко содержит SFCAs, известные как ингибиторы HDAC, способные модулировать апоптоз и клеточный цикл в раковых клетках желудка [13,51], а также экспрессию связанных с клеточным циклом и апоптотических белков в других раковых клетках [52,53]. Пробиотики уже использовались в клинических исследованиях для снижения побочных эффектов химиотерапии рака [54]. P. freudenreichii, согласно нашим результатам, может быть использован в таких клинических исследованиях. Его синергетический эффект может помочь снизить дозу препарата и улучшить комфорт пациентов.

В заключение, новое молоко, ферментированное исключительно P. freudenreichii, вызывало апоптоз в клетках рака желудка человека HGT-1. Кроме того, это ферментированное молоко усиливало цитотоксическую активность камптотецина, лекарственного средства, используемого при химиотерапии рака желудка. Такой новый пробиотический кисломолочный напиток может представлять интерес в качестве функциональной пищи для профилактики рака желудка и / или для потенциального терапевтического лечения.

Раздел «Материалы и методы» см. самостоятельно в источнике

Вспомогательная информация

Рис. S1. Популяция пропионибактерий и производство SCFAs 12-ю молочными штаммами пропионибактерий в ферментированном молоке. Двенадцать штаммов молочных пропионибактерий (дополнительная таблица S1) культивировали в течение 3 дней при 30°C. (A) популяции молочных пропионибактерий в ферментированном молоке определяли путем подсчета. B) производство короткоцепочечных жирных кислот молочными пропионибактериями в ферментированном молоке определяли методом ВЭЖХ. (A,B) результаты являются средствами по крайней мере двух независимых экспериментов.

Рис. S2. Кинетика гибели клеток, индуцированной пропионибактериальным метаболитом (А) или камптотецином (Б), определяется тремя методами. HGT-1 были обработаны как на диаграмме 1. Жизнеспособность контролировали методом исключения метиленового синего, МТТ и трипанового синего. Получены последовательные результаты.

Рис. S3. Временной ход, ведущий к 50% гибели клеток HGT-1 (T1/2) ультрафильтратом заквашенного молока или заквашенным молоком. Временной ход, приводящий к 50% гибели клеток HGT-1 (T1/2), определяли с помощью анализа метиленового синего, описанного на рисунке 1S. Результаты представляют собой средние значения трех экспериментов ± SD.

 

Рис. S4. Камптотецин индуцирует типичные ядерные признаки апоптоза в клетках рака желудка человека (положительный контроль на Рис.2). (А) Камптотецин-индуцированная ядерная конденсация. Клетки культивировали (Co.) или обрабатывали в течение 24, 48 или 72ч с 4 µM камптотецина. Затем клетки окрашивали Hoechst 33342 перед флуоресцентной микроскопией. Стрелки указывают на конденсацию хроматина (b), ядерную фрагментацию (c) и образование апоптотических тел (d). (B) Камптотецин-индуцированная фрагментация ДНК в клетках HGT-1. Геномную ДНК экстрагировали и анализировали в 1% агарозном геле. Клетки HGT-1 обрабатывали как в (A). (C) Камптотецин-индуцированные изменения в фазах клеточного цикла. Содержание ДНК клеток HGT-1 анализировали методом проточной цитометрии после окрашивания иодидом пропидия. Показаны репрезентативные гистограммы, соответствующие анализу содержания ДНК клеток HGT-1. Указан процент клеточной популяции с содержанием ДНК sub-G1, свидетельствующий об апоптозе. Доля каждого клеточного подмножества (sub-G1, G0/G1, S, G2/M) в общей популяции клеток показана для каждого времени лечения. Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов ± ± SD. *P<0,05, **P<0,01, обработанные клетки по сравнению с контролем (0 ч). Распределение фаз клеточного цикла необработанных клеток (контроль) оставалось неизменным в течение всего эксперимента.

Рис. S5. Камптотецин индуцирует воздействие фосфатидилсерина на наружный лист плазматической мембраны в раковых клетках желудка человека (положительный контроль на рис. 3). Проточная цитометрия, кинетический анализ гибели клеток в клетках HGT-1, обработанных 4 µM камптотецином. (A) показан репрезентативный эксперимент окрашивания клеток HGT-1 Аннексином V/7-AAD в каждый момент лечения с пропорциями Аннексин V-положительных клеток (AV+; апоптотические клетки). (B) количественный FACS-анализ связывания Аннексина V-FITC (AV) с клетками HGT-1 проводили после окрашивания 7-аминоактиномицином-D (7AAD). Представленные значения соответствуют доле каждого подмножества клеток в общей популяции клеток для каждого времени лечения. Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов ± SD. * P <0,05, ** P <0,01, обработанные клетки по сравнению с контролем (0 ч).

Рис. S6. ROS-акцептор TEMPOL снижает накопление пропионибактериальных метаболитов анион-супероксида (O₂^-).

Клетки HGT-1 обрабатывали, как на фиг. 4C, в присутствии или в отсутствие 5 mM TEMPOL. Проточная цитометрия анализа накопления анион супероксида (O₂^-) с окрашиванием DHE. (A) Наложения репрезентативного эксперимента по обнаружению ROS(активных форм кислорода, АФК). Клетки окрашивали дигидроэтидием и анализировали проточной цитометрией. В качестве положительного контроля использовали прооксидант менадион (Men., 100 µM, 15 min). (B) Значения представлены как доля клеток с повышенным ROS (увеличение интенсивности флуоресценции) в общей клеточной популяции для каждой обработки. Результаты представляют собой средние значения трех независимых экспериментов ± SD. * P <0,05, ** P <0,01, нет TEMPOL по сравнению с TEMPOL.

Таблица S1. Штаммы молочных пропионовокислых бактерий и их происхождение

Штамм a		Таксономия
CIRM	Другое имя	Род	вид	подвид
BIA1	CIP103027	Propionibacterium	freudenreichii	shermanii
BIA64	CNRZ80	Propionibacterium	acidipropionici
BIA116	CNRZ81	Propionibacterium	freudenreichii	freudenreichii
BIA125	ITG P14	Propionibacterium	freudenreichii	shermanii
BIA127	ITG P18	Propionibacterium	freudenreichii	freudenreichii
BIA129	ITG P20	Propionibacterium	freudenreichii	shermanii
BIA136	IS	Propionibacterium	freudenreichii	shermanii
BIA138	ITG P9	Propionibacterium	freudenreichii	shermanii
BIA455	CNRZ 87	Propionibacterium	jensenii
BIA458	IS	Propionibacterium	freudenreichii	shermanii
BIA527	-	Propionibacterium	freudenreichii	freudenreichii
BIA703	IS	Propionibacterium	freudenreichii	shermanii

^аКоллекции культур: CIRM-BIA, Международный центр микробных ресурсов - Бактерии пищевого интереса, INRA, Ренн; CIP: Коллекция Института Пастера, Париж, Франция; CNRZ: Национальный центр исследований в области животных, INRA, Jouy-en-Josas, Франция; ITG: Технический институт им. Грюйера, Актилайт, Ренн, Франция; IS: Промышленные штаммы, Standa Laboratories, Кан, Франция.

Таблица S2. Молочные пропионибактерии, ферментирующие молоко, вызывают апоптоз в колоректальных клетках человека HT-29.

a Обработка	b Потеря жизнеспособности HT-29 (%)	c Активность каспазы-3 (au/h/µg of proteins)
Контроль
Неферментированное молоко	9.72 ± 0.33	3.80 ± 0.55
Этопозид	67.82 ± 3.13	25.89 ± 1.54
C2/C3 (ацетат/пропионат)	81.95 ± 1.47	15.38 ± 0.65
Ферментированные молочные продукты
BIA 1	67,11 ± 2.87	5.97 ± 0.66
BIA 64	65,22 ± 0.35	104.15 ± 6.64
BIA 116	62,49 ± 1.36	N.D.
BIA 138	78,01 ± 2.72	44.28 ± 2.62
BIA 455	60,83 ± 0.86	N.D.

^aКлетки НТ-29 обрабатывали в течение 48 ч 1/2 разведением в DMEMc супернатантов, полученных из пяти ферментированных молочных продуктов. В качестве отрицательного контроля клетки обрабатывали 1/2 разведением неферментированного молока. В качестве положительного контроля клетки обрабатывали DMEMc, содержащей смесь ацетата и пропионата (C2 / C3, 15/30 мМ) или этопозида (100 мкМ).

^bПотери жизнеспособности HT-29 определяли анализом метиленового синего и рассчитывали, как описано в материалах и методах. Результаты представляют собой средние значения трех экспериментов ± SD.

^cСпецифическую активность каспазы-3 лизатов из клеток, обработанных, как указано выше, изучали с использованием указанных пептидов и рассчитывали, как описано в материалах и способах. Результаты представляют собой средние значения трех экспериментов ± SD. 

Источник: Cousin, F.J. Milk Fermented by Propionibacterium freudenreichii Induces Apoptosis of HGT-1 Human Gastric Cancer Cells / F.J. Cousin, S. Jouan-Lanhouet, M.T. Dimanche-Boitrel, L.Corcos, G. Jan // PLoS One. - 2012. - V. 7. - N 3.

Таким образом, важным аспектом применения молочных пропионовокислых бактерий P. freudenreichii ssp. является снижение риска и подавление развития опухолей в тканях человека. Представленные выше результаты исследований не единственные в своем роде. Так, в опытах ex vivo в 2004 году также были получены экспериментальные данные о рассасывании опухоли прямой кишки (колоректальной аденокарциномы) в присутствии клеток ПКБ. Следовательно, потенциал молочных пропионовокислых бактерий следует уже давно серьезно рассмотреть на предмет возможности широкого применения в клинической практике в терапии цациентов с раком желудка и кишечника.

Пробиотик Propionibacterium freudenreichii как новый адъювант для терапии на основе TRAIL при колоректальном раке

Краткое резюме

TNF-связанный лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), является хорошо известным индуктором апоптоза, который активирует внешний путь смерти. TRAIL проапоптотически действует на раковые клетки толстой кишки, но не цитотоксичен по отношению к нормальным здоровым клеткам. Однако его клиническое применение ограничено устойчивостью клеток к гибели клеток, которая встречается примерно в 50% раковых клеток. Также известно, что короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs) специфически индуцируют апоптоз раковых клеток. Соответственно, мы показали, что молочные пропионибактерии пищевого качества вызывают внутренний апоптоз раковых клеток толстой кишки за счет производства и высвобождения SCFAs (пропионата и ацетата), действующих на митохондрии. Здесь мы исследовали возможный синергетический эффект между Propionibacterium freudenreichii и TRAIL. Действительно, мы предположили, что воздействие как на внешние, так и на внутренние пути смерти может оказывать синергетический проапоптотический эффект. Полный транскриптомный анализ продемонстрировал, что пропионибактериальный супернатант или пропионибактериальные метаболиты (пропионат и ацетат) в сочетании с TRAIL увеличивают экспрессию проапоптотических генов (TRAIL-R2 / DR5) и снижают экспрессию антиапоптотических генов (FLIP, XIAP) в клетках рака толстой кишки человека HT29. Выявленный синергический проапоптотический эффект, зависящий как от рецепторов смерти (TRAIL-R1/DR4, TRAIL-R2/DR5), так и от активации каспаз (каспазы-8, -9 и -3), был смертельным для раковых клеток, но не для нормальных клеток кишечного эпителия человека (HIEC), и ингибировался экспрессией Bcl-2. Наконец, молоко, ферментированное P. freudenreichii, индуцировало апоптоз клеток HT29 и увеличивало цитотоксическую активность TRAIL, так же как и супернатанты культуры DMEM P. freudenreichii или его метаболиты SCFA. Эти результаты открывают новые перспективы для пищевых продуктов, содержащих P. freudenreichii, с целью усиления терапии рака толстой кишки на основе TRAIL.

Подробнее см. в статье: Fabien J Cousin, et al. The probiotic Propionibacterium freudenreichii as a new adjuvant for TRAIL-based therapy in colorectal cancer. Oncotarget. 2016 Feb 9;7(6):7161-78

Литература:

Литература к 1 разделу

Литература ко 2-му разделу

Willet WN . 2000 Diet and Cancer The Oncologist 5 : 393 – 404 Fuller R . 1989 Probiotics in man and animals J. Appl. Bacteriol. 66 : 365 – 378 Britz T, Steyn P . 1979 Volatile fatty acid production by the dairy and clinical propionibacteria and related coryneforms Phytophylactica 11 : 111 – 115 Hague A, Singh B, Paraskeva C . 1997 Butyrate acts as a survival factor for colonic epithelial cells: further fuel for the in vivo versus in vitrodebate Gastroenterology 112 : 1036 – 1040 Hague A, Elder DJ, Hicks DJ, Paraskeva C . 1995 Apoptosis in colorectal tumour cells: induction by the short chain fatty acids butyrate, propionate and acetate and by the bile salt deoxycholate Int. J. Cancer60 : 400 – 406 Scheppach W, Bartram HP, Richter F . 1995 Role of short-chain fatty acids in the prevention of colorectal cancer Eur. J. Cancer 31A : 1077 – 1080 Heerdt BG, Houston MA, Augenlicht LH . 1997 Short-chain fatty acid-initiated cell cycle arrest and apoptosis of colonic epithelial cells is linked to mitochondrial function Cell Growth Differ. 8 : 523 – 532 Marchetti C, Migliorati G, Moraca R, Riccardi C, Nicoletti I, Fabiani R, Mastrandrea V, Morozzi G . 1997 Deoxycholic acid and SCFA-induced apoptosis in the human tumor cell-line HT-29 and possible mechanisms Cancer Lett. 14 : 97 – 99 Zoratti M, Szabo I . 1995 The mitochondrial permeability transition Biochim. Biophys. Acta. 1241 : 139 – 176 Marzo I, Brenner C, Zamzami N, Susin SA, Beutner G, Brdiczka D, Rémy R, Xie ZH, Reed JC, Kroemer G . 1998a The permeability transition pore complex: a target for apoptosis regulation by caspases and Bcl-2-related proteins J. Exp. Med. 187 : 1261 – 1271 Marzo I, Brenner C, Zamzami N, Jürgensmeier JM, Susin SA, Vieira HLA, Prévost MC, Xie Z, Matsuyama S, Reed JC, Kroemer G . 1998b Bax and Adenine Nucleotide Translocator Cooperate in the Mitochondrial Control of Apoptosis Science 281 : 2027 – 2031 Jacotot E, Ravagnan L, Loeffler M, Ferri KF, Vieira HL, Zamzami N, Costantini P, Druillennec S, Hoebeke J, Briand JP, Irinopoulou T, Daugas E, Susin SA, Cointe D, Xie ZH, Reed JC, Roques BP, Kroemer G . 2000 The HIV-1 viral protein R induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore J. Exp. Med. 191 : 33 – 46 Jacotot E, Ferri KF, El Hamel C, Brenner C, Druillennec S, Hoebeke J, Rustin P, Metivier D, Lenoir C, Geuskens M, Vieira HL, Loeffler M, Belzacq AS, Briand JP, Zamzami N, Edelman L, Xie ZH, Reed JC, Roques BP, Kroemer G . 2001 Control of Mitochondrial Membrane Permeabilization by Adenine Nucleotide Translocator Interacting with HIV-1 Viral Protein R and Bcl-2 J. Exp. Med. 193 : 509 – 520 Decaudin D, Marzo II, Brenner C, Kroemer G . 1998 Mitochondria in chemotherapy-induced apoptosis: A prospective novel target of cancer therapy Int. J. Oncol. 12 : 141 – 152 Costantini P, Jacotot E, Decaudin D, Kroemer G . 2000 Mitochondrion as a novel target of anticancer chemotherapy J. Natl. Cancer Inst. 92 : 1042 – 1053 Belzacq AS, Jacotot E, Vieira HL, Misro D, Granville DJ, Xie Z, Reed JC, Kroemer G, Brenner C . 2001 Apoptosis induction by the photosensitizer verteporfin: identification of mitochondrial adenine nucleotide translocator as a critical target Cancer Res. 61 : 1260 – 1264 De Pablo M, Susin SA, Jacotot E, Larochette N, Costantini P, Ravagnan L, Zamzami N, Kroemer G . 1999 Palmitate induces apoptosis via a direct effect on mitochondria Apoptosis 4 : 81 – 87 Rippo MR, Malisan F, Ravagnan L, Tomassini B, Condo I, Costantini P, Susin SA, Rufini A, Todaro M, Kroemer G, Testi R . 2000 GD3 ganglioside directly targets mitochondria in a Bcl-2-controlled fashion Faseb. J. 14 : 2047 – 2054 Kroemer G, Reed JC . 2000 Mitochondrial control of cell death Nat. Med. 6 : 513 – 519 Vieira HL, Haouzi D, El Hamel C, Belzacq AS, Brenner C, Kroemer G . 2000 Mitochondrial membrane permeabilization during apoptosis. Impact of the adenine nucleotide translocator Cell Death Differ. 7 : 1146 – 1154 Brenner C, Cadiou H, Vieira HL, Zamzami N, Marzo I, Xie Z, Leber B, Andrews D, Duclohier H, Reed JC, Kroemer G . 2000 Bcl-2 and Bax regulate the channel activity of the mitochondrial adenine nucleotide translocator Oncogene 19 : 329 – 336 Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y . 1999 Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC Nature 399 : 483 – 487 Vogelstein B, Lane D, Levine AJ . 2000 Surfing the p53 network Nature 16 : 307 – 310 Fulda S, Susin SA, Kroemer G, Debatin KM . 1998a Molecular ordering of apoptosis induced by anticancer drugs in neuroblastoma cells Cancer Res. 58 : 4453 – 4460 Fulda S, Scaffidi C, Susin SA, Krammer PH, Kroemer G, Peter ME, Debatin KM . 1998b Activation of mitochondria and release of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic acid J. Biol. Chem.273 : 33942 – 33948 Ravagnan L, Marzo I, Costantini P, Susin SA, Zamzami N, Petit PX, Hirsch F, Goulbern M, Poupon MF, Miccoli L, Xie Z, Reed JC, Kroemer G . 1999 Lonidamine triggers apoptosis via a direct, Bcl-2-inhibited effect on the mitochondrial permeability transition pore Oncogene 18 : 2537 – 2546 Larochette N, Decaudin D, Jacotot E, Brenner C, Marzo I, Susin SA, Zamzami N, Xie Z, Reed J, Kroemer G . 1999 Arsenite induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore Exp. Cell Res. 249 : 413 – 421 Marchetti P, Zamzami N, Joseph B, Schraen-Maschke S, Mereau-Richard C, Costantini P, Metivier D, Susin SA, Kroemer G, Formstecher P . 1999 The novel retinoid 6-[3-(1-adamantyl)-4-hydroxyphenyl]-2-naphtalene carboxylic acid can trigger apoptosis through a mitochondrial pathway independent of the nucleus Cancer Res. 59 : 6257 – 6266 Genini D, Adachi S, Chao Q, Rose DW, Carrera CJ, Cottam HB, Carson DA, Leoni LM . 2000 Deoxyyadenosine analogs induce programmed cell death in chronic lymphocytic leukemia cells by damaging the DNA and by directly affecting the mitochondria Blood 96 : 3537 – 3543 Watabe M, Machida K, Osada H . 2000 MT-21 is a synthetic apoptosis inducer that directly induces cytochrome c release from mitochondria Cancer Re. 60 : 5214 – 5222 Jan G, Leverrier P, Pichereau V, Boyaval P . 2001 Changes in protein synthesis and morphology during acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii Appl. Environ. Microbiol. 67 : 2029 – 2036 Jan G, Rouault A, Maubois J . 2000 Acid stress susceptibility and acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii Lait 80 : 325 – 336 Goldmacher VS, Bartle LM, Skaletskaya A, Dionne CA, Kedersha NL, Vater CA, Han J, Lutz RJ, Watanabe S, McFarland ED, Kieff ED, Mocarski ES, Chittenden T . 1999 A cytomegalovirus-encoded mitochondria-localized inhibitor of apoptosis structurally unrelated to Bcl-2 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 : 12536 – 12541 Chai F, Evdokiou A, Young GP, Zalewski PD . 2000 Involvement of p21(Waf1/Cip1) and its cleavage by DEVD-caspase during apoptosis of colorectal cancer cells induced by butyrate Carcinogenesis 21 : 7 – 14 Schonfeld P, Bohnensack R . 1997 Fatty acid-promoted mitochondrial permeability transition by membrane depolarization and binding to the ADP/ATP carrier FEBS Lett. 420 : 167 – 170 Schonfeld P, Jezek P, Belyaeva EA, Borecky J, Slyshenkov VS, Wieckowski MR, Wojtczak L . 1996 Photomodification of mitochondrial proteins by azido fatty acids and its effect on mitochondrial energetics. Further evidence for the role of the ADP/ATP carrier in fatty-acid-mediated uncoupling Eur. J. Biochem.240 : 387 – 393 Starkov AA, Markova OV, Mokhova EN, Arrigoni-Martelli E, Battelli D, Bobyleva VA . 1993 The protective effect of cyclosporine A, carnitine, and Mg2+ with ADP during calcium 2+-dependent permeabilization of mitochondria by fatty acids and activation of NADH oxidation by an external pathway Biochemistry 58 : 1266 – 1275 Wieckowski MR, Wojtczak L . 1998 Fatty acid-induced uncoupling of oxidative phosphorylation is partly due to opening of the mitochondrial permeability transition pore FEBS Lett. 423 : 339 – 342 Von Engelhardt W, Burmester M, Hansen K, Becker G, Rechkemmer G . 1993 Effects of amiloride and ouabain on short-chain fatty acid transport in guinea pig intestine J. Physiol. (London) 460 : 455 – 466 Chen YL, Yu CK, Lei HY . 1999 Propionibacterium acnes induces acute TNF alpha-mediated apoptosis of hepatocytes followed by inflammatory T-cell-mediated granulomatous hepatitis in mice J. Biomed. Sci. 6 : 349 – 356 Bouglé D, Roland F, Lebeurrier F, Arhan P . 1999 Effect of propionibacteria supplementation on fecal bifidobacteria and segmental colonic transit time in healthy human subjects Scand. J. Gastroenterol. 2 : 145 – 148 Hague A, Diaz GD, Hicks D, Krajewski S, Reed JC, Paraskeva C . 1997 bcl-2 and bak may play a pivotal role in sodium butyrate-induced apoptosis in colonic epithelial cells; however overexpression of bcl-2 does not protect against bak-mediated apoptosis Int. J. Cancer 72 : 898 – 905 Csordas A, Kofler R . 1999 Apoptosis induced by the histone deacetylase inhibitor sodium butyrate in human leukemic lymphoblasts FASEB J. 13 : 1991 – 2001 Bingham SA . 1990 Mechanisms and experimental and epidemiological evidence relating dietary fibre (non-starch polysaccharides) and starch to protection against large bowel cancer Proc. Nutr. Soc. 49 : 153 – 171 Avivi-Green C, Polak-Charcon S, Madar Z, Schwartz B . 2000 Apoptosis cascade proteins are regulated in vivo by high intracolonic butyrate concentration: correlation with colon cancer inhibition Oncol. Res. 12 : 83 – 95 Perrin P, Pierre F, Patry Y, Champ M, Berreur M, Pradal G, Bornet F, Meflah K, Menanteau J . 2001 Only fibres promoting a stable butyrate producing colonic ecosystem decrease the rate of aberrant crypt foci in rats Gut 48 : 53 – 61 Tuomola EM, Ouwehand AC, Salminen SJ . 2000 Chemical, physical and enzymatic pre-treatments of probiotic lactobacilli alter their adhesion to human intestinal mucus glycoproteins Int. J. Food Microbiol. 60 : 75 – 81 Tuomola EM, Ouwehand AC, Salminen SJ . 1999 Human ileostomy glycoproteins as a model for small intestinal mucus to investigate adhesion of probiotics Lett. Appl. Microbiol. 28 : 159 – 163 Ouwehand AC, Tuomola EM, Tolkko S, Salminen S . 2001 Assessment of adhesion properties of novel probiotic strains to human intestinal mucus Int. J. Food Microbiol. 64 : 119 – 126 Zamzami N, Susin SA, Marchetti P, Hirsch T, Gómez-Monterrey I, Castedo M, Kroemer G . 1996 Mitochondrial control of nuclear aptotosis J. Exp. Med. 183 : 1533 – 1544 Costantini P, Belzacq AS, Vieira HL, Larochette N, de Pablo MA, Zamzami N, Susin SA, Brenner C, Kroemer G . 2000 Oxidation of a critical thiol residue of the adenine nucleotide translocator enforces Bcl-2-independent permeability transition pore opening and apoptosis Oncogene 19 : 307 – 314 См. дополнительно: Бифидобактерии могут быть эффективными в предотвращении колоректального рака Штаммы Bifidobacterium могут быть эффективными в предотвращении CRC посредством их ингибирующего воздействия на клетки MAIT.

Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, et al. (2011) Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 61: 69–90. Palli D (2000) Epidemiology of gastric cancer: an evaluation of available evidence. J Gastroenterol 35: 84–89. Compare D, Rocco A, Nardone G (2010) Risk factors in gastric cancer. Eur Rev Med Pharmacol Sci 14: 302–308. Diaz-Ruiz C, Montaner B, Perez-Tomas R (2001) Prodigiosin induces cell death and morphological changes indicative of apoptosis in gastric cancer cell line HGT-1. Histol Histopathol 16: 415–421. Lin HH, Chen JH, Huang CC, Wang CJ (2007) Apoptotic effect of 3,4-dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/p38 MAPK signaling activation. Int J Cancer 120: 2306–2316. Ran ZH, Xu Q, Tong JL, Xiao SD (2007) Apoptotic effect of Epigal locatechin-3-gallate on the human gastric cancer cell line MKN45 via activation of the mitochondrial pathway. World J Gastroenterol 13: 4255–4259. Kim JE, Kim SY, Lee KW, Lee HJ (2009) Arginine deiminase originating from Lactococcus lactis ssp lactis American Type Culture Collection (ATCC) 7962 induces G(1)-phase cell-cycle arrest and apoptosis in SNU-1 stomach adenocarcinoma cells. Br J Nutr 102: 1469–1476. Kim SY, Kim JE, Lee KW, Lee HJ (2009) Lactococcus lactis ssp. lactis inhibits the proliferation of SNU-1 human stomach cancer cells through induction of G0/G1 cell cycle arrest and apoptosis via p53 and p21 expression. Ann N Y Acad Sci 1171: 270–275. Experts from FAO/WHO (2006) Probiotics in food: health and nutritional properties and guidelines for evaluation. FAO Food Nutr Pap. Kumar M, Kumar A, Nagpal R, Mohania D, Behare P, et al. (2010) Cancer-preventing attributes of probiotics: an update. Int J Food Sci Nutr 61: 473–496. Wong JMW, de Souza R, Kendall CWC, Emam A, Jenkins DJA (2006) Colonic health: fermentation and short chain fatty acids. J Clin Gastroenterol 40: 235–243. Bordonaro M, Lazarova DL, Sartorelli AC (2008) Butyrate and Wnt signaling - A possible solution to the puzzle of dietary fiber and colon cancer risk? Cell Cycle 7: 1178–1183. Matthews GM, Howarth GS, Butler RN (2007) Short-chain fatty acid modulation of apoptosis in the Kato III human gastric carcinoma cell line. Canc Biol Ther 6: 1051–1057. Tsai LC, Hung MW, Chang GG, Chang TC (2000) Apoptosis induced by the sodium butyrate in human gastric cancer TMK-1 cells. Anticancer Res 20: 2441–2448. Yan J, Xu YH (2003) Tributyrin inhibits human gastric cancer SGC-7901 cell growth by inducing apoptosis and DNA synthesis arrest. World J Gastroenterol 9: 660–664. Elmore S (2007) Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicol Pathol 35: 495–516. Kurosaka K, Takahashi M, Watanabe N, Kobayashi Y (2003) Silent cleanup of very early apoptotic cells by macrophages. J Immunol 171: 4672–4679. Savill J, Fadok V (2000) Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature 407: 784–788. Jan G, Belzacq AS, Haouzi D, Rouault A, Metivier D, et al. (2002) Propionibacteria induce apoptosis of colorectal carcinoma cells via short-chain fatty acids acting on mitochondria. Cell Death Differ 9: 179–188. Lan A, Lagadic-Gossmann D, Lemaire C, Brenner C, Jan G (2007) Acidic extracellular pH shifts colorectal cancer cell death from apoptosis to necrosis upon exposure to propionate and acetate, major end-products of the human probiotic propionibacteria. Apoptosis 12: 573–591. Hervé C, Fondrevez M, Cheron A, Barloy-Hubler F, Jan G (2007) Transcarboxylase mRNA: a marker which evidences P. freudenreichii survival and metabolic activity during its transit in the human gut. Int J Food Microbiol 113: 303–314. Lan A, Bruneau A, Philippe C, Rochet V, Rouault A, et al. (2007) Survival and metabolic activity of selected strains of Propionibacterium freudenreichii in the gastrointestinal tract of human microbiota-associated rats. Br J Nutr 97: 714–724. Lan A, Bruneau A, Bensaada M, Philippe C, Bellaud P, et al. (2008) Increased induction of apoptosis by Propionibacterium freudenreichii TL133 in colonic mucosal crypts of human microbiota-associated rats treated with 1,2-dimethylhydrazine. Br J Nutr 100: 1251–1259. Leverrier P, Fremont Y, Rouault A, Boyaval P, Jan G (2005) In vitro tolerance to digestive stresses of propionibacteria: influence of food matrices. Food Microbiol 22: 11–18. Saxelin M, Lassig A, Karjalainen H, Tynkkynen S, Surakka A, et al. (2010) Persistence of probiotic strains in the gastrointestinal tract when administered as capsules, yoghurt, or cheese. Int J Food Microbiol 144: 293–300. Thierry A, Deutsch SM, Falentin H, Dalmasso M, Cousin FJ, et al. (2011) New insights into physiology and metabolism of Propionibacterium freudenreichii. Int J Food Microbiol 149: 19–27. Bortner CD, Oldenburg NBE, Cidlowski JA (1995) The role of DNA fragmentation in apoptosis. Trends Cell Biol 5: 21–26. Chou TC, Talalay P (1984) Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv Enzyme Regul 22: 27–55. Cousin FJ, Mater DDG, Foligné B, Jan G (2011) Dairy propionibacteria as human probiotics: A review of recent evidence. Dairy Sci Technol 91: 1–26. Sohn D, Schulze-Osthoff K, Janicke RU (2005) Caspase-8 can be activated by interchain proteolysis without receptor-triggered dimerization during drug-induced apoptosis. J Biol Chem 280: 5267–5273. Fischer U, Stroh C, Schulze-Osthoff K (2005) Unique and overlapping substrate specificities of caspase-8 and caspase-10. Oncogene 25: 152–159. Fulda S (2009) Caspase-8 in cancer biology and therapy. Cancer Lett 281: 128–133. Hopkins-Donaldson S, Bodmer JL, Bourloud KB, Brognara CB, Tschopp J, et al. (2000) Loss of caspase-8 expression in highly malignant human neuroblastoma cells correlates with resistance to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis. Cancer Res 60: 4315–4319. Eggert A, Grotzer MA, Zuzak TJ, Wiewrodt BR, Ho R, et al. (2001) Resistance to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis in neuroblastoma cells correlates with a loss of caspase-8 expression. Cancer Res 61: 1314–1319. Kaminskyy V, Surova O, Vaculova A, Zhivotovsky B (2011) Combined inhibition of DNA methyltransferase and histone deacetylase restores caspase-8 expression and sensitizes SCLC cells to TRAIL. Carcinogenesis. Hinnebusch BF, Meng SF, Wu JT, Archer SY, Hodin RA (2002) The effects of short-chain fatty acids on human colon cancer cell phenotype are associated with histone hyperacetylation. J Nutr 132: 1012–1017. Grunstein M (1997) Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature 389: 349–352. Lu Y, Zhang BY, Jia ZX, Wu WJ, Lu ZQ (2011) Hepatocellular carcinoma HepG2 cell apoptosis and caspase-8 and Bcl-2 expression induced by injectable seed extract of Coix lacryma-jobi. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 10: 303–307. Slee EA, Harte MT, Kluck RM, Wolf BB, Casiano CA, et al. (1999) Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol 144: 281–292. Viswanath V, Wu Y, Boonplueang R, Chen S, Stevenson FF, et al. (2001) Caspase-9 activation results in downstream caspase-8 activation and bid cleavage in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease. J Neurosci 21: 9519–9528. Inoue S, Browne G, Melino G, Cohen GM (2009) Ordering of caspases in cells undergoing apoptosis by the intrinsic pathway. Cell Death Differ 16: 1053–1061. Aune D, Lau R, Chan DSM, Vieira R, Greenwood DC, et al. (2011) Dairy products and colorectal cancer risk: a systematic review and meta-analysis of cohort studies. Ann Oncol 1–9: Sanders ME, Marco ML (2010) Food formats for effective delivery of probiotics. Annu Rev Food Sci Technol 1: 65–85. Fujita K, Matsuda E, Sekine K, Iigo M, Tsuda H (2004) Lactoferrin enhances Fas expression and apoptosis in the colon mucosa of azoxymethane-treated rats. Carcinogenesis 25: 1961–1966. Xu XX, Jiang HR, Li HB, Zhang TN, Zhou Q, et al. (2010) Apoptosis of stomach cancer cell SGC-7901 and regulation of Akt signaling way induced by bovine lactoferrin. J Dairy Sci 93: 2344–2350. de Moreno de LeBlanc A, Perdigon G (2010) The application of probiotic fermented milks in cancer and intestinal inflammation. P Nutr Soc 69: 421–428. Thiel A, Eikmanns B, Salminen S, Ouwehand AC (2004) In vitro adhesion of propionibacteria to human intestinal mucus. Ital J Food Sci 16: 245–253. Zarate G, De Ambrosini VIM, Chaia AP, Gonzalez SN (2002) Adhesion of dairy propionibacteria to intestinal epithelial tissue in vitro and in vivo. J Food Prot 65: 534–539. Myllyluoma E, Ahonen AM, Korpela R, Vapaatalo H, Kankuri E (2008) Effects of multispecies probiotic combination on Helicobacter pylori infection in vitro. Clin Vaccine Immunol 15: 1472–1482. Baldwin C, Millette M, Oth D, Ruiz MT, Luquet FM, et al. (2010) Probiotic Lactobacillus acidophilus and L. casei mix sensitize colorectal tumoral cells to 5-fluorouracil-induced apoptosis. Nutr Cancer 62: 371–378. Litvak DA, Hwang KO, Evers BM, Townsend CM (2000) Induction of apoptosis in human gastric cancer by sodium butyrate. Anticancer Res 20: 779–784. Coradini D, Pellizzaro C, Marimpietri D, Abolafio C, Daidone MG (2000) Sodium butyrate modulates cell cycle-related proteins in HT29 human colonic adenocarcinoma cells. Cell Prolif 33: 139–146. Litvak DA, Evers BM, Hwang KO, Hellmich MR, Ko TC, et al. (1998) Butyrate-induced differentiation of Caco-2 cells is associated with apoptosis and early induction of p21(Waf1/Cip1) and p27(kip1). Surgery 124: 161–169. Prisciandaro LD, Geier MS, Butler RN, Cummins AG, Howarth GS (2011) Evidence supporting the use of probiotics for the prevention and treatment of chemotherapy-induced intestinal mucositis. Crit Rev Food Sci Nutr 51: 239–247. Michalski MC, Leconte N, Briard-Bion V, Fauquant J, Maubois JL, et al. (2006) Microfiltration of raw whole milk to select fractions with different fat globule size distributions: Process optimization and analysis. J Dairy Sci 89: 3778–3790. Laboisse CL, Augeron C, Couturierturpin MH, Gespach C, Cheret AM, et al. (1982) Characterization of a newly established human gastric cancer cell line HGT-1 bearing histamine H-2-receptors. Cancer Res 42: 1541–1548. Gibot L, Follet J, Metges JP, Auvray P, Simon B, et al. (2009) Human caspase 7 is positively controlled by SREBP-1 and SREBP-2. Biochem J 420: 473–483. Dimanche-Boitrel MT, Pelletier H, Genne P, Petit JM, Legrimellec C, et al. (1992) Confluence-dependent resistance in human colon cancer-cells - Role of reduced drug accumulation and low intrinsic chemosensitivity of resting cells. Int J Cancer 50: 677–682. Verrier F, Deniaud A, LeBras M, Metivier D, Kroemer G, et al. (2004) Dynamic evolution of the adenine nucleotide translocase interactome during chemotherapy-induced apoptosis. Oncogene 23: 8049–8064. Meurette O, Lefeuvre-Orfila L, Rebillard A, Lagadic-Gossmann D, Dimanche-Boitrel MT (2005) Role of intracellular glutathione in cell sensitivity to the apoptosis induced by tumor necrosis factor alpha - Related apoptosis-inducing ligand/anticancer drug combinations. Clin Cancer Res 11: 3075–3083. Banjerdpongchai R, Kongtawelert P, Khantamat O, Srisomsap C, Chokchaichamnankit D, et al. (2010) Mitochondrial and endoplasmic reticulum stress pathways cooperate in zearalenone-induced apoptosis of human leukemic cells. J Hematol Oncol 3: 1–16. Lacour S, Micheau O, Hammann A, Drouineaud V, Tschopp J, et al. (2003) Chemotherapy enhances TNF-related apoptosis-inducing ligand DISC assembly in HT29 human colon cancer cells. Oncogene 22: 1807–1816.

К разделу: Роль микробиома в развитии и терапии рака

Будьте здоровы!